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化学发光免疫分析 purpose 化学发光免疫分析概述 Know： 1.化学发光剂标记物的制备 2.化学发光免疫技术的临床应用 本章内容 小 结 1.发光：指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后再返回到基态，并释放光子的过程。 2.化学发光:是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发光。 3.化学发光免疫分析:是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术 4.类型：分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。 思考题 1．发光、化学发光、CLIA、ECLIA。 2．常用的化学发光剂有哪些？ 3．吖啶酯化学发光的原理和特点是什么？ 4．酶促反应的发光剂有哪些？其发光原理是什么？ 5．三联吡啶钌发光的原理和特点是什么？ 6.试述化学发光免疫分析的常用技术类型。 三大经典标记技术 一、发光 （2）对羟基苯乙酸（HPA） （2）4-MUP Section 3 化学发光免疫分析技术的类型 一、发光酶免疫分析 类型一：荧光酶免疫分析 类型二:化学发光酶免疫分析 （二）技术类型 2.B与F分离---固相分离法 3.酶促发光反应 4.标准曲线制作和本结果计算 （三）方法学评价 灵敏度较高。 易产生较高本底。 洗涤不彻底，易产生非特异性酶发光反应 若含影响标记酶活性的物质，会影响结果测定。 二、化学发光免疫分析 （二）技术要点 3.化学发光反应与结果计算 （三）方法学评价 1.AE发光反应简单，发光快速而无须催化剂。 2.AE可直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标记物的生物学活性和理化特性。 3.试剂有效期可达一年。 4.分离简便、快捷。 5.为瞬间发光，持续时间短，对信号检测仪的灵敏度要求比较高。 （二）技术要点 2.B和F分离磁与ECL反应 3.结果计算 （三）方法学评价 1.试剂灵敏度高，（pg/ml水平），稳定性好。 2.持续发光，信号强，易测定，易控制。 3.不影响标记物的理化特性。 Section 4 临床应用（广泛） 1.激素检测：甲状腺激素、生殖激素、垂体激素等 2.肿瘤及病毒标志物检测：AFP、CA类、乙肝两对半、抗HIV 3.感染性疾病：病原体抗原抗体 4．贫血因子：维生素B12、叶酸、红细胞叶酸、铁蛋白 5．糖尿病：胰岛素、血清C-肽、血浆胰高糖素。 6．过敏性疾病:总IgE、特异性IgE 7．心脏标志物：肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）等 8．治疗药物监测：茶碱、地高辛、环孢素、巴比妥等。 分析步骤 AE－Ag/Ab＋Ab/Ag＋磁珠－Ag/Ab 磁场 分离B与F 氧化剂（H2O2） NaOH 发光 检测发光强度 （与待测抗原的量成正比，从标准曲线上 计算出待测抗原的含量。） （一）原理 发光 Y Y Y 磁微粒 被测抗原 + 抗体 + AE标记抗体 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 冲洗后 --- 夹心法 加入H2O2 （pH10） 加入碱 （pH10） 化学发光免疫分析(图解) 1.抗原抗体反应（同酶发光免疫测定技术） （1）双抗体夹心法 （2）双抗原夹心法 （3）固相抗原竞争法 2.B和F的分离　 常用磁颗粒分离技术 接收----放大---记录1秒钟内所产生的光子能 ----光强度与被测抗原量成正相关----根据标准曲线 仪器自动计算出待测抗原含量。 发光 Y Y Y Y 冲洗后 加入H2O2 （pH10） 加入碱 （pH10） (Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA） 三、电化学发光免疫分析 （一）原理 电化学发光（ECL）+ 免疫测定+磁颗粒分离 电化学＋化学发光 电化学发光剂[Ru（bpy）3]2+ Ab(Ag) 标记 电化学发光免疫分析技术原理示意图 光电倍增管检测 1.抗原抗体反应（同酶发光免疫测定技术） （1）双抗体夹心法 （2）双抗原夹心法 （3）固相抗原竞争法 [Ru(bpy)3]2+-抗体-待测抗原-抗体-生物素-链霉亲和素-磁珠复合体 颗粒分离技术----电极加电压，启动ECL反应 光电倍增管检测光强度， 光强度与待检抗原的浓度呈正相关, 根据标准曲线算出待测抗原的含量。 标记磁颗粒在电场中发光工作示意图 周而复始 分配样品, 磁颗粒 和试剂 孵育 使反应物 结合 在磁场中 清洗去除 未结合物质 加入 底物 产生 信号 孵育, 促使信号 的产生 信号 检测 （一）常用标记方法1. 碳二亚胺（EDC）缩合法 酰胺键 2. 过碘酸钠氧化法 3．重氮盐偶联法 酚羟基邻位 4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法 酰胺键 在碱性条件下被H2O2氧化时,