《双向电泳》.ppt

双 向 电 泳 蛋白质组分析的首要要求 将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。 二、一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG） 泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。 三、两维间的平衡 一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于－80°保存数月。 但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS是电泳能顺利进行。 建议方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（pH8.8）缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15min。 四、二维SDS同普通SDS类似。 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。 聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测 五、有机染料和银染 考染灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。 银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。 这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。 六、凝胶的图像处理分析和 典型流程 凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递和解释： 2-DE数据库的建立： 七、蛋白质的胶内酶切 包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程 * * 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(2-DE)结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。 通常第一维电泳是等电聚焦，在细管中（φ1～3 mm）中加入含有两性电解质、8M的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出，用含有SDS的缓冲液处理30 min，使SDS与蛋白质充分结合。 将处理过的凝胶条放在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上，加入熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。在第二维电泳过程中，结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS－聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其分子量大小被分离(三大效应）。 可溶性样品 固体组织样品 细胞 不同样品的基本处理方法不同 样品的分级处理 通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。 一、样品制备 IPG胶条的重泡胀