HSV2gD模拟抗原表位P6、HBsAg、IL18重组核酸疫苗的构建及其免疫效果观察.pdf

的构建及免疫效果观察 Y1 研究生：郑绮菡 专业：病原生物学 导师：于爱莲教授 王玉副教授 中文摘要 目的 构建包含单纯疱疹病毒HSV艺gD模拟抗原表位P6、乙型肝炎病毒表面抗原 组合及观察优势组合的动物免疫效果，为开发多抗原核酸疫苗提供新的理论和实践资 料。 方法 1．重组质粒pc扎18一S、pc_S的构建 将含有Ⅺ10lI和EcoR I和B觚lH 正确后，再用EcoR V和 克隆入酶切回收后的pc．ILl8质粒中，构建重组质粒pC—ILl8一S。将含有Ec0R 质粒和pc．S质粒均为阳性对照组。 2．含有重叠区S片段的扩增 以测序正确的S基因为模板，以含有另一模板部分序列的上下游引物为引物，采 用简并引物PCR方法扩增含有重叠区的S片段。 建 4．间接免疫荧光筛选优势质粒及Wbtemblot验证靶抗原的表达 据检测结果筛选出优势质粒。W_e咖lb10t验证筛选出的优势质粒中S抗原和P6或 ‘ NP6抗原的表达。 5．优势质粒免疫BALB，c小鼠并观察免疫效果 首次免疫前三天(d)用普鲁卡因在质粒待免疫处进行预处理。在第Od、14d、30d 于小鼠双下肢股四头肌处注射重组质粒50u【g／只，且首次免疫辅加弗氏完全佐剂(质 粒：弗氏佐剂=1：1)，阴性对照组加弗氏完全佐剂而空白对照组不加。在首次免疫后 ．S水平和抗．P6或抗加6水平。末次加强免疫后四周脱臼处死小鼠，并无菌取脾分 离淋巴细胞，经计数后于96孔板培养，48小时后Mrr法检测淋巴细胞增殖情况。 结果 1．重组质粒的构建及筛选： 三基因融合片段；利用酶切连接方法得到Ⅲ18．S片段。 ②通过不同的限制性内切酶酶切及连接，获得重组质粒pc．ILl8．P6．S、 ③通过多次间接免疫荧光实验，证实各重组质粒所携带的}玎3sAg基因、P6或NP6 基因在真核细胞中均可成功表达，且所要筛选的重组质粒pc．ILl8一P6．S、 8在真核细胞中 差异，故认为所构建的四种重组质粒中pc-S．P6．ILl8和pc．S加6．ILl 8 的表达情况优于pc．ILl8-P6-S和pc-ILl8加6一S，选择pc．S-P6一几18和pc—S加6一ILl 为优势质粒。 ④W|eStem 细胞中表达的S抗原可以检测到，但表位抗原P6和NP6并未检测到。 2．优势质粒对小鼠的免疫效果观察： 同pc．S姗6一ILl8组(O．09)比较，差异不显著，P=o．1670．05。 组(1．35)比较，差异不显著，P==0．210加．05。 结论 。 1．重叠PCR法是体外获得多序列、短片段串联产物的有效方法。 3．BALB／C小鼠接种重组质粒可有效提高其体液免疫应答和细胞免疫应答，且 4．携带多个外源基因的串联重组克隆具有良好的体内外表达活性；且串联基因的 相对位置差异，会影响靶抗原的表达。本研究发现，m18位于S抗原的羧基端其免 疫效果优于位于S抗原的氨基端，’这可为新型核酸疫苗的开发研究提供一点思路。 关键词 重叠PCR；HSV之gD模拟抗原表位；几l8；髓sAg：免疫效果 CoNSTRUCTIONoFTHERECOMBINANTOF