hTERT启动子介导的E1A%2fIL-24共表达靶向腺病毒载体对肝癌抑瘤效应及其分子机制的研究.pdfVIP

hTERT 启动子介导的 E1A/IL-24 共表达靶向腺病毒载体对肝癌抑瘤效应及其分子机制研究 中文摘要 hTERT 启动子介导的 E1A/IL-24 共表达靶向腺病毒载体 对肝癌抑瘤效应及其分子机制研究 中文摘要 目的 构建 hTERT 启动子介导的 E1A/IL-24 共表达靶向腺病毒载体 （pAd-hTERT-E1A-IL-24 ），研究其对肝癌的抑瘤效应，并从细胞凋亡和生长周期、 血管形成、浸润等方面，探索其抗肿瘤作用的分子机制。 方法 按分子克隆原理，用套式PCR 从MCF-7 的DNA 基因组中亚克隆出hTERT 启动子(hTERTp)，将其插入pTrack 质粒转移载体形成pTrack-hTERT 。PCR 扩增目的 片段E1A 、polyA-promoter 和IL-24 基因，依次亚克隆至pTrack-hTERT 转移载体，构 建 pTrack-hTERT-E1A-polyA-promoter-IL-24 双基因共表达靶向转移载体。同理构建 pTrack-CMV-E1A-polyA-promoter-IL-24 双基因共表达转移载体。上述二个构建正确 的转移载体及pTrack 空载体经PmeI 酶切后与pAdEasy-1 腺病毒骨架质粒在BJ5183 大肠杆菌中同源重组，得到的同源重组质粒 pAd-hTERT-E1A-IL-24 （靶向）、 pAd-CMV-E1A-IL-24 及pAd 经PacI 酶切、再用脂质体转染QBI-293A 包装细胞，经 多轮感染和扩增后获得高滴度的 Ad-hTERT-E1A-IL-24 （简称Ad-h-E1A-IL-24 ）、 Ad-E1A-IL-24 及Ad 病毒子。将5、10、25 、50 及100 MOI 的Ad 分别感染SMMC-7721 肝癌细胞，筛选出Ad 的最佳感染剂量为25 MOI 。将最佳感染剂量的Ad-h-E1A-IL-24 和Ad-E1A-IL-24 病毒子分别感染 SMMC-7721 肝癌细胞和HL7702 人正常肝细胞， 流式细胞仪鉴定两种病毒对该细胞的感染率，MTT 鉴定其对正常细胞的毒性作用。 将体外培养的 SMMC-7721 肝癌细胞分成 PBS 、Ad 、Ad-E1A-IL-24 及 Ad-h-E1A-IL-24 组，分别加入最佳感染剂量的上述腺病毒。RT-PCR 、间接免疫荧光 法和Western Blot 法检测外源性E1A 和IL-24 在SMMC-7721 细胞中的转录与表达； MTT 法检测体外抑制肝癌细胞及人正常肝细胞HL7702 生长效应，Hoechst 33258 荧 光染色及 FCM 检测其诱导肝癌细胞凋亡效应，RT-PCR 法检测凋亡、细胞周期调节 及肿瘤浸润相关的细胞因子 Bax 、Bcl-2 、P21 、MMP2 、MMP9 、TIMP1 、TIMP2 基因的转录表达；并建立裸鼠SMMC-7721 人肝癌荷瘤模型，观察体内抑瘤作用。将 成瘤后的裸鼠分为PBS 、Ad 、Ad-E1A-IL-24 及Ad-h-E1A-IL-24 组，每组5 只。病毒 干预后测肿瘤体积及瘤重。免疫组化法检测外源性E1A 及IL24 在荷瘤中的表达，检 I 中文摘要 hTERT 启动子介导的 E1A/IL-24 共表达靶向腺病毒载体对肝癌抑瘤效应及其分子机制研究 测细胞凋亡、肿瘤浸润及血管形成相关因子 Bax 、Bcl-2 、Fas 、Caspase3 、MMP2 、 MMP9 、VEGF 和CD34 的表达。 结果 成功构建了hTERT 启动子和CMV 介导的E1A 和IL-24 共表达腺病毒载 体，并得到表达高价Ad-h-E1A-IL-24 和Ad-E1A-IL-24 的腺病毒载体病毒子。25 MOI 的最佳感染剂量的Ad-h-E1A-IL24 和Ad-E1A-IL24 两组病毒子对肝癌细胞的感染率 分别65.53%和41.71% （P0.01 ）。Ad-h-E1A-IL24 病毒子对HL7702 的毒性作用明