玫烟色棒束孢几丁质酶Ⅱ基因克隆、表达两种几丁质酶诱导转录.pdfVIP

摘 要 虫生真菌作为农林生态系中昆虫的重要致死因子，具有显著的流行潜力，对维持 生态平衡具有重要作用。有些虫生真菌已被开发为真菌杀虫剂，进而广泛地应用于防 治农林害虫。玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea作为一类较为常见的虫生真菌，世界性 分布，可寄生鳞翅目、同翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目等多类昆虫。玫烟色棒束孢 在北美和欧洲已被用于温室害虫的生物防治，目前已有真菌杀虫剂产品登记注册用于 温室粉虱、蚜虫、蓟马和介壳虫的防治。 前人研究表明，虫生真菌中常常存在多个几丁质酶，但各自在侵染中的作用主次 尚未阐明。本课题组在先前的研究中，克隆获得了一个玫烟色棒束孢的几丁质酶 Ifuchit1 。在本研究中，我们运用RT-PCR和DNA步移技术从玫烟色棒束孢中又分离得 到了一种新的几丁质酶基因Ifuchit2 ，序列已递交国际权威基因数据库GenBank登录， 序列号为HQ267382 。该基因全长1584bp，5′端非翻译区111bp，3′端非翻译区有202bp, 开放阅读框(ORF)1272bp, 编码423个氨基酸。信号肽长度为22个氨基酸。其编码蛋白 理论分子量为46.57kDa ，理论等电点为5.169 。423个氨基酸中含强碱氨基酸37个（K ， R ），强酸氨基酸48个（D ，E ），疏水氨基酸150个（A ，I ，L ，F ，W ，V ），极性氨基 酸119个（N ，C，Q ，S，T ，Y ）。通过Blast对保守区进行预测,发现该几丁质酶基因 含有几丁质的活性位点（DGIDIDWE ）和结合区域（SIGG），属于糖基水解酶18家族。 又运用特异性PCR扩增和DNA步移技术，分别从玫烟色棒束孢中克隆得到几丁质酶的 基因组序列和上游序列。结构基因总长1425 bp，扩出的结构基因DNA与其cDNA 比较 含有三个内含子，分别位于距离起始密码子的121碱基至176碱基处，277碱基至331 碱基处和380碱基至431碱基处，大小分别为54bp，53bp，51bp 。在玫烟色棒束孢几丁 质酶Ifuchit2 结构基因的基础上，克隆得到了其上游序列。该基因上游序列大小为 1794bp （序列号：JF323024 ），其中有209bp与该基因cDNA序列相互重叠。序列分析 表明，玫烟色棒束孢几丁质酶Ifuchit2 上游序列中，含有真核生物基因典型的TATA- 盒，以及多个高度保守的潜在转录因子结合位点, 如 Oct1 、 GATA-1 、 GATA-2 、 CdxA 等。另外，该上游序列还存在一些特异的应答元件，如热激应答元件（HSE ）、 胁迫应答元件（STRE ）等。 将克隆获得的玫烟色棒束孢几丁质酶 Ifuchit2 基因连接到分泌性表达载体 pPIC9K 上后，通过电转化，转入毕赤酵母 GS115 。经甲醇诱导 144h，离心收集上清， 测定酶活 37.3U/ml 。将表达后的几丁质酶粗酶液，通过 80%硫酸铵蛋白沉淀，离心 收集沉淀，并用 50mmol/L pH8.0 的Tris-HCl 缓冲液溶解后，在相同的缓冲液中透析 24h ，离心弃沉淀。酶液经DEAE-Sepharose 柱进行蛋白纯化。将具有活性的收集液采 用 PEG20000 进行浓缩。最后以 SDS凝胶检测该蛋白，得到分子量为 46kDa I 左右，与预测的结果（46.57kDa ）及相关报道结果相接近。 玫烟色棒束孢 RCEF3304 菌株在粉状几丁质为诱导物的条件下，经 12h，36h， 60h 诱导后，提取总 RNA 。同时根据几丁质酶Ifuchit2 基因和几丁质酶 Ifuchit1 基因 序列设计引物，利用 Realtime-PCR 荧光检测技术比较两种几丁质酶基因在诱导前后 自身转录水平以及两者之间表达量变化的差异，结果表明两种几丁质酶基因经诱导 后，转录量均有所提高，且几丁质酶 Ifuchit1 的基因无论在诱导前还是诱导后，转录 表达量都明显高于 Ifuchit2 ，两者的表达量相差大约十几倍。因此，我们推测这两种 几丁质酶属于诱导性酶，且Ifuchit1 可能是玫烟色棒束孢几丁质酶类的主效基因，在 菌株侵染过程中起主要作用。 关键词：虫生真菌，玫烟色棒束孢，几丁质酶，酵母表达，实时荧光定量 II