WesternBlotting技术.pptVIP

Western Blotting实验技术 定义 印迹法（blotting）：是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探针反应来检测样品的一种方法。 Southern Blot ：1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法。 实验目的 检测一个基因的表达产物是否正确 -- 定性 比较表达产物量的相对变化 -- 半定量 基本流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 基本流程 制备流程 细胞破碎 1、液氮研磨法 2、机械匀浆法 3、超声波处理法 4、反复冻融法：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐 浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5、化学裂解法：去氧胆酸钠、SDS 6、酶解法：细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理；植物 细胞壁可用纤维素酶处理。 蛋白提取 水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。 细胞裂解液（RIPA）： 50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，0.1% SDS，1%NP-40，0.5% 去氧胆酸钠，1 mmol/L PMSF，2μg/mL Aprotinin，2μg/mL Leupeptin（使用前加），pH7.5 有机溶剂提取法 对于分子中非极