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基因工程实验模块 一、质粒DNA的提取和鉴定 各种试剂的作用： 实验步骤 * 一、质粒DNA的提取和鉴定 二、目的基因的获得和重组载体的构建 三、感受态细胞的制备、转化及重组子筛选 四、目的基因在E.coli中表达与SDS鉴定 实验一、质粒DNA的小量制备 实验二、质粒DNA的电泳鉴定 实验三、质粒DNA的酶切 实验一、质粒DNA的小量制备 掌握质粒DNA提取的碱裂解方法。 实验目的： 实验试剂 1）LB培养基： 10g/L 胰蛋白胨 5g/L 酵母提取物10g/L NaCl 用5N NaOH调pH至7.0，121℃高压灭菌20min。 用无菌H2O配置100mg/ml ，-20℃保存； 在LB中的终浓度为100 ?g/ml。 2）Amp贮存液： 4）STE： 10mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 1mmol/L EDTA （pH8.0） 0.1mol/L NaCl 3）TE： 10mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 1mmol/L EDTA 5）溶液 I： 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 10mmol/L EDTA（pH8.0） 121℃高压灭菌20min，4℃保存。 6）溶液 II： 0.2 mol/L NaOH 1% SDS 注意：配0.2mol/L NaOH时，临用前用10mol/L贮存液现用现稀释。 7）溶液 III： 5mol/L KAc 60ml 冰HAc 11.5ml H2O 28.5ml pH为4.8，4℃保存。 8）25:24:1 酚:氯仿:异戊醇 9）氯仿 10）无水乙醇 11）70% 乙醇 10）RNase： 10mmol/L Tris-HCl（pH7.5） 15mmol/L NaCl 10mg/ml RNase 11）质粒贮存液： 含20?g/ml RNase的TE或H2O 1）葡萄糖 增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力的作用而降解（震荡）。 2）EDTA Mg2+、Ca2+螯合剂，抑制DNase活性，防止DNA被降解。 3）NaOH-SDS NaOH是强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS是离子型表面活性剂，溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白质-SDS”复合物，使蛋白质（包括DNase）变性沉淀。 4）NaAc-HAc缓冲液 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。 用于沉淀DNA。 5）乙醇 DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。 一般使用2倍体积的无水乙醇。 6）RNaseA 降解残留的RNA，以免提取后的DNA中含有小分子RNA。 7）TE缓冲液： DNA保存液，由Tris-HCl和EDTA配制。 EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。 Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），利于以后操作。 但苯酚会残留在DNA溶液中（现已少用，多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。 8）酚-氯仿-异戊醇 蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 3）将细菌沉淀重悬于0.5ml STE中，12000rpm离心1min，弃上清。 1）将菌落接种于2ml含100?g/ml的LB中，37℃振摇过夜。 2）取1.5ml培养物于1.5ml Eppendorf管中，于4℃离心12000rpm?1min，弃上清。 4）将细菌沉淀重悬于100?l 4℃预冷的溶液I中，盖紧管口，vortex剧烈振荡，使细菌沉淀完全分散，放置5-15min。 5）加200?l溶液II，盖紧管口，快速颠倒Eppendorf管5次，使管整个内表面均与溶液II接触（不要振荡），冰上放置5-10min。 6）加入150?l 4℃预冷的溶液III，盖紧管口，温和振荡10sec，冰上放置5min。 7）4℃离心15000rpm?5min，将上清转移至另一EP管中。 8）加入等量酚-氯仿-异戊醇，振荡混匀，于4℃离心15000rpm?2min，将上清转移至另一EP管中。 9）加入等量氯仿，振荡混匀，于4℃离心15000rpm?2min，将上清转