棉铃虫中肠Cry1A结合蛋白分离、鉴定及和抗性的关系.pdf

摘要 转基因棉花的大规模种植对控制棉花害虫的危害发挥了重要作用，但害虫长期处于转基因作 物Bt毒蛋白的高压选择下，害虫对Bt作物抗性问题将不容忽视。昆虫对Bt毒素的抗性机制是复 杂和多样的，但中肠结合位点的改变是最主要的一种机制。棉铃虫中已知的受体有氨肽酶N和钙 粘蛋白。保存在本实验室的高抗CrylA蛋白的棉铃虫品系经前人研究未发现该品系存在钙粘蛋白 基因的缺失、失活，比较抗、感品系棉铃虫的钙粘蛋白、APN序列，只发现少量氨基酸的变异， 因此该棉铃虫品系对CrylA产生抗性很可能与受体蛋白表达水平变化相关或存在其它的受体蛋 白。 本文首先比较了西种双向电泳系统以及几种BBMV提取方法对双向电泳的影响，建立了棉 铃虫中肠Bt结合蛋白蛋白质组学的研究方法，利用蛋白质组学的方法分离和分析了棉铃虫中肠 CrylA毒素的结合蛋白，比较了抗、感品系棉铃虫中CrylAc结合蛋白的变化，探讨该棉铃虫品 系对Bt毒蛋白产生抗性的可能机制。并比较了抗、感品系棉铃虫中与不同Bt毒蛋白作用的结合 蛋白的差异。在国内首次开展了利用蛋白质组学研究棉铃虫的中肠Bt结合蛋白及其与抗性的关 系。主要结果如下： ． 尤其对高分子量蛋白的分离明显优于IPG．DALT法，但由于上样量少，因此对后续的质谱分析非 结果显示这三种方法对分离CrylAc结合蛋白的种类没有影响，但这三种方法获得的蛋白量不一 样结果。总结三种方法的优点，建立了一种新的综合BBMV提取方法，获得了高量的蛋白，通 过双向电泳和结合试验证明该方法适合双向电泳CrylA结合蛋白研究。 热激蛋白和未知新蛋白为首次报道的昆虫中肠CrylAc结合蛋白。 3、用蛋白质组学的方法比较了抗、感棉铃虫中肠结合蛋白的数量和表达量，结果发现结合 蛋白种类无差异，但其中一种新的结合蛋白在抗性品系中表达量至少下降了6．49倍。前人的研究 说明，碘标记结合试验证明结合位点或受体数目减少是该抗性品系对CrylA毒蛋白产生抗性的主 要原因。结合前人研究和本文结果，本文新结合蛋白表达量严重降低可能是该抗性品系产生抗性 的原因之一。 无论是抗性品系和敏感品系CrylAb的结合都是最少的，在敏感品系中，CrylAb未结合肌动蛋白 品系中结合蛋白的差异还是存在于新蛋白的表达量上，新蛋白表达量下降可能与交互抗性产生有 关，也可能存在其他的原因。 关键词棉铃虫，Bt，结合蛋白，蛋白质组学，抗性 Abstract Thewide ofBtcottonhas an roleincotton plant are spread playedimportant pestcontrol，pests selectedunderthe of Bttoxin Btcottonfora the pressurehigh—dose time，therefore producedby long of resistanceevolutiontoBtcottonshouldnotbe resistancemechaniamofBttoxin pest ignored．The to insectsis and the ofthe inthe isthemainone． variable，but complex changebindingproteinsmidgut in Theknown cotton receptors bollworm(Helicoverpaarmigera(H让bne0，CBW)areAminoopeptidase C