名贵枫斗类石斛的分子鉴别及其微卫星标记的开发的研究.pdf

摘要 摘 要 石斛为传统名贵中药材，历史悠久，早在《神农本草经》中就被列为上品， 有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功效。根据形态特征和加工规格的不同，分 为枫斗类石斛和黄草类石斛两大类，而铁皮石斛、兜唇石斛、齿瓣石斛皆属名贵 枫斗类石斛。本文作者拟运用一种基于适配器连接介导的等位基因特异性扩增法 对铁皮石斛、兜唇石斛、齿瓣石斛等名贵的枫斗类石斛进行鉴别研究。通过三条 特异性引物和一条通用引物，兜唇石斛、齿瓣石斛、铁皮石斛分别扩增出大小为 198 bp、250 bp 、310 bp 的片段。三条片段可以在2.0% 的琼脂糖凝胶电泳清晰分 开。此外运用这四条引物，在其它 14 种枫斗类石斛中没有扩增出任何片段。研 究结果表明，通过同时检测 rDNA ITS 的三个特异性位点，ALM-ASA 可以鉴别 此三种名贵枫斗类石斛。 本研究对常见枫斗类石斛的叶绿体基因组 psb A-trnH 区进行了测定，利用 MEGA 3.0 对该区序列进行了比较分析。结果显示：15 种枫斗类石斛psb A-trnH 序列长度为 721-767 bp，变异位点 42 个，简约信息位点 11 个。以 Kimura-2 参 数计算遗传距离，15 种枫斗类石斛种间遗传距离在 0.0013-0.0183，平均遗传距 离为 0.0148 。不同石斛种间均存在序列差异，全序列中共出现6 处 indels，导致 种间片段长度差异较大。枫斗类石斛居群间psb A-trnH 区序列暂没发现差异。 本研究还运用磁珠富集法对报春石斛的微卫星进行了开发。开发步骤如下： 用 Sau3AI 酶切报春石斛基因组 DNA ，加接头进行连接，根据接头的序列设计引 物进行 PCR ，用生物素标记的(AG)8 和(AC)15 两种探针于不同杂交温度分别与之 杂交，然后利用链霉亲和素包裹的磁珠富集含有微卫星 DNA 的片段，再经PCR 扩增后，进行克隆测序。本研究共成功开发出 28 条微卫星序列，并对其中的 8 条设计了微卫星引物。筛选出的 8 对微卫星引物，为以后进行的报春石斛遗传多 样性、品种鉴定和系统发育的研究提供重要的基础。 关键词：石斛属，枫斗类石斛，ALM-ASA ，分子鉴别，psb A-trnH ，微卫星 I Abstract Abstract Hebra Dendrobii was listed as the most precious traditional Chinese medicine in “Shen Nong Ben Cao Jing”. It is divided into two classes in terms of morphological characters and processing methods, namely “Huangcao Shihu” and “Fengdou Shihu”. Dendrobium aphyllum, Dendrobium devonianum and Dendrobium officinale are three valuable Dendrobium species of “Fengdous”. The adapter ligation-mediated allele-specific amplification (ALM-ASA) has been applied to authenticate these three valuable Dendrobium species. Three species-specific primers and a universal primer were designed. By using these primers, three amplification products are 198 bp (D . aphyllum), 250 bp (D . devonianum), and 310 bp (D . offficinale) in lengt