当归对小鼠骨髓细胞增殖的影响及其相关细胞信号通路研究.pdf

摘要 本论文研究中药，主要是当归对小鼠骨髓细胞增殖的影响，及对MAPK．JAK—sTAT 两条细胞信号通路的作用。 论文分为三部分内容。 第一部分是药物的选择和作用条件的优化。根据中药的药性，选择了4种有代表性的药 物，即补血药当归，理气药黄芪，滋阴药枸杞和祛风湿药雷公藤。采用这4种药物的制剂， 观察对小鼠骨髓细胞增殖的影响。 粒单核祖细胞集落形成及髓过氧化物酶活性测定结果表明，当归和黄芪提取物具有促进 粒单核细胞系列增殖的能力。分别检测了0．1mg／ml，ImghnI，10mg]ml3个不同剂量，作用有量 效关系。当归提取物的作用在lOmg／ml剂量较强，能增加CFU—GM形成数73％，MPO比 比酶活增加96％。 形成数和MPO比酶活的影响。 雷公藤制剂一一雷公藤多苷的作用是抑制性的，以O01rng／ml，0．Img／ml，1mg／ml三个不 同浓度进行研究，1m∥m1剂量作用较强，使CFU—GM形成数下降41％，MPO比酶活下降 77％。 根据上述结果，从中选择具有良好促骨髓细胞增殖能力的当归进行作用条件优化，继而 进一步深入研究。 以密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离出单个核细胞，采用噻唑蓝比色法测定其生长增殖 能力。分别对细胞培养第1—7天每日测定，作出细胞生长曲线。结果表明，第3天是明显 的快速增殖期，适合于进一步研究。 在新鲜分离的单个核细胞中加入不同浓度的当归注射液，比较细胞生长增殖速度的变 化。结果发现，lmg／rnl浓度具有较强的作用效果。 常规细胞培养液中的胎牛血清含有多种促进细胞生长的活性因子，可能掩盖药物作用， 因此，在短期培养中目前有许多研究采用无血清培养。我们采用10％胎牛血清，5蚓眙牛血 清，无血清3种不同条件的培养液，观察当归的作用。 实验结果表明，无血清条件下当归注射液呈现出明显的促进细胞增殖能力，在作用较强 的1mg／ml剂量，能增加单个核细胞增殖444％。而在含10％胎牛血清及5％胎牛血清的培 养液，当归的促增殖作用在很大程度上被细胞的背景增殖所掩盖。因此，在后面细胞信号通 路的研究中，我们采用无血清或根据方法要求采用背景很低的O．5％血清。 论文的第二部分是当归制剂对单个核细胞增殖中MAPK信号通路的影响。 MAPK细胞信号通路是调节细胞生长增殖的一条重要途径，在细胞内信号传递中起枢 不同的亚型引起不同的细胞变化。ERKI／2，SAPK／JNK，P38是三种主要的亚型。 MAPK蛋白通过关键位点氨基酸的磷酸化而活化，这种变化可用特异性抗体加以检测。 在本文中，采用流式细胞术方法研究MAPK蛋白的活化。 对当归刺激后单个核细胞的MAPK分析表明，ERKl／2和P38MAPK蛋白被磷酸化活化， 作用自当归刺激30min后开始。而SAPIGJNK蛋白无明显变化。 进一步需要研究MAPK蛋白的这种变化对于细胞增殖有什么意义。我们选择以MAPK 特异性抑制剂阻断通路，观察细胞增殖的相应变化。 以ERKI／2抑制剂PD98059与单个核细胞共孵育，当归促增殖作用下降了57．3％；P38 明显影响。 上述结果证明，在当归引起的小鼠骨髓单个核细胞增殖中，ERKl／2和P38MAPK起到 了介导作用。 本论文的第三部分是研究当归制剂对另一条细胞信号通路——JAK．STAT信号通路的 影响。 JAK—STAT信号通路是调节细胞增殖的重要途径，细胞外的化学信号经过膜上受体，激 活JAK，继而活化STAT。胞浆中的STAT激活后移行入核，与DNA相应片断结合，引起 相关基因的活化。与MAPK信号通路相仿，STAT元件也有多种形式，包括STATl{，它们常 和STAT5作为研究对象。实验结果表明，当归刺激后，单个核细胞的STAT3和STAT5被磷 酸化活化，而STATl活性不变。 激活持续约60min．STAT5有微弱的基础激活，当归加入30min后，开始出现磷酸化活化的 明显增加。 总之，本论文的研究发现，中药当归，黄芪制剂对于小鼠骨髓细胞的增殖具有促进作用， 而以当归的作用较为明显。并且，当归的促增殖作用与MAPK和JAK-STAT两条信号通路 的活化有关。 关键词： 当归 骨萌细胞 单个核细胞 粒单核祖细胞集落 髓过氧化物酶 信号转导子和转录激活子 有丝分裂原激活的蛋白激酶 信号转导子和转录激活子 ABSlRACT