芽孢杆菌漆酶基因的克隆表达和分子定向进化.pdf

Code：1 University0225 Code：B14016 Register Dissertationforthe of Doctor Degree ／’ ● ● oene and moleculardirected clonlnR，exoresslon evolutionoflaccasesfromBacillus sp． Candidate： Fengju Ouyang Supervisor： ZhaoMin Associate Supervisor： Academic for： Doctor DegreeApplied Speciality： Microbiology Dateof0ralExamination： June，2014 Northeast University： ForestryUniversity 万方数据 摘要 摘要 漆酶(1accase)，是一种典型的绿色催化剂，应用范围广泛。目前工业化的漆酶商 品主要来源真菌发酵。但在高温、高盐或强碱性等极端环境中，真菌漆酶易失活，限制 了其应用范围。相比之下，细菌漆酶具有耐高温、耐高碱性的优势，且发酵生产周期 短，具有广阔的推广前景。为获得生产周期短，活性高的细菌漆酶，本文克隆了芽孢杆 菌属的漆酶基因，并在大肠杆菌中进行了原核表达，利用分子定向进化手段获得表达量 高、热稳定性较好、碱性环境耐受力较强的细菌漆酶突变株，并研究了突变漆酶的酶学 特性和空间结构，在此基础上又进行了突变漆酶降解染料的研究，获得如下研究结果： (1)扩增解淀粉芽孢杆菌(Bacillus LS05)和枯草芽孢杆菌 amyloliquefaciens (Bacillussubtilis LS03)的漆酶基因。比对基因序列的同源性为74％，氨基酸序列同源 LS03 性为77％。丑subtilis 物信息学方法推测其分子量58．5kDa。将丑subtilisLS03cotA漆酶基因与表达载体 酶，经低温微好氧环境诱导表达，重组CotA蛋白表现出漆酶的催化活性。 表达产物存在于菌体破碎后的上清液中，经Ni-NTA亲和层析纯化后获得62kDa的 目的蛋白，测得其比酶活为1．44 U／mg。酶学性质研究表明，纯蛋白催化两种底物的最 用；10％浓度的有机溶剂可以维持漆酶活性60％以上；常规蛋白抑制剂能够抑制漆酶的 活性；与底物丁香醛连氮(SGZ)具有较好的亲和性。 Shuffling的多样性母本同源基因，通过Fami