酶法合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸及反应动力学的研究.pdf

fIlrlfl l lrllll IIIII IIItll Y2083769 摘要 催化转移至相应的氨基酸或二肽上，形成新的含Y．肽键的化合物。目前，利用GGT 制备系列谷氨酰基化合物的研究已成为国内外生物催化领域的研究热点。 本文以一种极具应用前景的肺结核治疗药物1．D．Glu．L．Trp为对象，对 GGT的分离纯化、酶学性质以及转肽反应过程进行了较深入的研究。具体研究内 容如下： (1)通过对GGT纯化方法的研究，建立了一种新的GGT纯化方法。发酵 o／o～1 液经离心后取上清，以80 00％饱和度硫酸铵梯度沉淀，以Tri．HCl缓冲液 8．0，O．05 (pH mol／L)复溶，经透析后以DEAEFF层析分离，上样缓 Sepharose 8．0，0．05mol／L) 冲为Tris．HCl(pH8．0，0．05moFL)，洗脱液为Iris．HCl(pH +1mol／LNaCI：洗脱梯度为5％--60％B，20 min，收集活性峰；收集液经透析 后，再以Sourcel5Q离子交换层析分离，上样缓冲与洗脱液同上，洗脱梯度为0 0／0,,,40％B，30 min，收集活性峰。通过以上步骤可得到电泳纯的GGT，比酶活 为26．6 U／mg，纯化倍数33．25倍，酶活回收率为9．4％。 (2)通过SDS．PAGE电泳分析，由BacillussubtilisNX．2产生的GGT分子 量约为80KDa，含有两条亚基，其分子量分别为55kDa和25kDa，与其他来源 GGT存在一定的差异。 反应动力学常数进行了研究：确定了GGT催化转肽反应的最适反应温度为40℃， 最适pH mmol／L，转肽反应最大反应速度(‰)为0．034mmol／(min·L)，转肽反应催化 常数l(c砒为231．48 mmol／L，水解反应最大反应速度(rmax)为0．012 mmol／(min·L)，水解反应催化 常数K’龃t为81．72min-1。 (4)结合反应进程曲线研究了酶法合成丫．D．Glu．L．Trpl拘反应机理：D．Gin 作为酰基供体虽能消除自转肽反应，但GGT对产物的水解作用仍然存在且不可 逆，实际转化过程中形成了一个级联反应，因此要获得最大的产物得率必须对反 (6)利用建立的动力学模型模拟分析了不同工况下转肽反应过程，分析了 初始酶浓度、供体底物浓度、受体底物浓度的改变对转肽反应进程的影响。结果 表明，增大酶量有利于提高反应速率，转肽／水解达到平衡的时间明显缩短，但 对反应平衡无影响；升高供体底物(D．Gln)初始浓度使产物得率明显上升，且 D．Gin转化率也有所提高；降低受体底物(L．哪)初始浓度使产物转化率(相 对于L．Trp)不断提高，反应平衡可维持较长时间。 (7)利用Q 分离纯化。通过优化流动相pH、脱洗脱梯度及进样量，确定最佳分离条件为： mol／LNaCl的A相；样品进样量： A相：pH8．0的Tris．HCl缓冲液；B相：含1 5mL(样品浓度6．7 min。纯化后样品经 mg／mL)；洗脱梯度：030％B，30 甲醇脱盐、冷冻干燥后，即可得到纯品1，．D．Glu．L．Trp，HPLC分析其纯度可达 99％。利用1H NMR和旋光分析对产物进行结构表征，确定其为丫．D．Glu．L．Trp。 关键词：丫-谷氨酰转肽酶；1，·D-谷氨酰-L一色氨酸；酶法合成：动力学模型 Ⅱ