DNA-PKcs对c-myc蛋白稳定性调控作用研究.pdf

DNA—PKcs对c-myc蛋白稳定性 调控作用的研究 摘 要 ProteinKinase DNA—PKcs是DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位(D1qAD印endent catalvtic kin船e—related口rotein 色体端粒末端结构稳定性中发挥重要的作用。研究显示DNA．PKcs以其丝氨酸一苏氨 酸蛋白激酶活性可磷酸化多种重要的功能蛋白底物，包括有多种癌基因产物和转录因 近年来有越来越多的实验研究报道，DNA．PKcs在肿瘤组织中异常高表达。如 均高于正常组织，Um等发现在侵袭转移能力强的肿瘤组织中D时A—PKcs的蛋白表达 和激酶活性高于侵袭转移能力低的肿瘤细胞，由此推测DNA-PKcs与肿瘤转移相关 联。此外，某些组织来源细胞的不同发育阶段DNA．PKcs的表达水平也不同，生殖细 胞减数分裂前DNA．PKcs表达明显高于减数分裂后，而一些没有增殖能力的细胞根本 辐射诱发的部分癌变细胞中DNA．PKcs表达和激酶活性均显著提高；通过免疫组化分 析显示约90％的肝癌患者的癌组织中DNA．PKcs表达呈强阳性，而对照的正常肝组 和激酶活性也明显高于癌旁组织。本论文在前期研究结果的启示下，对DNA—PKcs 的功能以及作为抗癌靶分子的可行性进行深入研究，取得了如下主要进展： 果显示TFP对HeLa细胞的生长有明显的抑制作用，并诱发细胞凋亡，随着药物剂量 的增大和用药时间的延长，细胞生长速度减慢，凋亡率增加，而且TFP可增加细胞 对辐射的敏感性。进一步分析其分子机制发现，TFP或T射线作用HeLa细胞后，都 军事医学科学院博士论文 安静，2005年5月 程度，从而促进细胞凋亡的发生，增强细胞对辐射的敏感性。另外，MAPK激酶p38 激活被认为在HeLa细胞中起对抗凋亡的作用，抑制p38活化可有效促进细胞凋亡的 发生，实验结果表明TFP可抑制Y射线诱导的p38磷酸化，从而促进细胞凋亡。 (2)为了进～步研究DINA．pKcs在肿瘤发生和恶性转化中的作用，我们利用更 DNA．PKcs表达沉默的稳定细胞模型。结果表明细胞对Y射线及紫外线的敏感性增加， D咐A．PK-cs表达沉默细胞的生长速度和接种裸鼠后形成肿瘤的生长速度减慢。这些结 果表明DNA．PKcs除通过其DNA修复功能影响细胞的辐射敏感性外，还可能与肿瘤 细胞增殖有关。 (3)利用基因芯片技术对DNA．PKcs表达沉默细胞以及对照细胞进行了细胞信 号转导相关基因的mI矾A表达水平比较，发现15个与细胞信号转导有关的基因在 DNA．PKcs表达沉默细胞中表达升高，其中一半是与干扰素信号转导反应有关的基 因。8个基因表达下降，包括有细胞增殖和侵袭转移相关基因等。RT_PcR半定量分 析结果与芯片结果相一致。又利用SEAP报告质粒系统进行检测，进一步证实其中的 NⅣ汀转录活性下降。以上结果提示DNA-PKcs具有直接或间接调控细胞信号转导相 关基因的表达，两且大多与细胞增殖分化有关。值得注意的是，其中部分是c曲yc 的靶基因如P2l、P27、NDRG．1。 表达水平明显下降，细胞中c—myc蛋白对靶基因转录的激活作用也随之降低。 能通过此信号通路在一定程度上参与细胞的恶性转化。 2 军事医学科学院博士论文 安静，2005年5月 号通路，为此又做了迸一步分析验证。用泛素化蛋白酶体的抑制剂(MGl32)及GsK3 信号通路提供了关键性实验依据。 异性PcR方法检测DNA转录偶联修复的新技术，利用此技术研究发现，对照细胞 基因转录链，而两组细胞的泛基因组修复水平无明显差异，首次表明DNA．PKcs参与 DNA转录偶联修复反应。 恶性转化中的生物学意义，提供了关键性实验依据。鉴于本研究结果，DNA．PKcs将 是一个抗肿瘤药物或技术措施研究的一个有效分子靶标。本研究还揭示了DNA．PKcs 的DNA转录偶联修复功能。 白泛素化；细胞信号转导；DNA转录偶联修复 军事医学科学院博士论文