CXCL12-CXCR4生物轴和卵巢上皮性癌腹腔转移关系研究.pdf

中文摘要 摘 要 目的：卵巢上皮性癌(简称卵巢癌)是妇科肿瘤领域中最具有挑战性 的疾病，其死亡率居女性生殖道恶性肿瘤之首。卵巢癌高死亡率主要是因 为该病在确诊时70％的患者是晚期，疾病的范围已经超过卵巢扩散到腹 腔和腹膜后淋巴结，而晚期卵巢癌的五年生存率则长期徘徊在30％左右。 与其他多种类型的癌不同，卵巢癌的主要转移途径不是通过血管，而是腹 腔转移。由于在腹腔的广泛种植和转移常常引起严重腹水和肠梗阻，所以 卵巢癌的腹腔转移是直接引起患者死亡的主要原因。因此深入了解调控卵 巢癌腹腔选择性转移的机制十分重要，将对卵巢癌的治疗产生深远的影 响。卵巢癌的腹腔播散转移特性除了与其解剖和机械的原因有关外，还主 要是由于腹腔液中、腹水中存在和腹膜间皮细胞产生的趋化因子、生长因 子、粘附因子等发挥了重要的作用。卵巢癌生长晚期，大网膜和腹膜是常 见的转移部位。卵巢癌转移的目的地腹膜间皮细胞(human peritoneal mesohelial 线，具有多种生理和病理功能。本课题组前期的研究发现，正常卵巢上皮 者之间有非常高的亲和力。本课题拟通过构建稳定表达CXCR4卵巢癌细 胞株及人腹膜间皮细胞的原代培养，到体外细胞实验，最后动物实验来证 癌生长转移中的作用，从而更好的理解卵巢癌腹腔转移的机制，为抗卵巢 癌腹腔转移的治疗寻找新的途径。 方法：本课题分为三部分： 1稳定表达CXCR4的卵巢癌细胞株的建立与鉴定及其增殖、迁移、 定，结果证实正确。采用阳离子脂质体介导的转染方法，将高表达CXCR4 中文摘要 转染卵巢癌细胞SKOV3，经G418筛选并且通过单细胞分离技术获得了 数个单细胞，转染成功的细胞经RT．PCR，Westem blot和免疫细胞化学 方法鉴定。将转染质粒、转染载体及未转染的三种卵巢癌细胞SKOV3进 行体外培养。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法进行增殖实验，判断 在无牛血清培养液的生长条件下，不同浓度的CXCLl2对三种细胞增殖 AMD3100的抑制作用。 2人腹膜间皮细胞的原代培养及其对卵巢癌细胞黏附、迁移、侵袭力 影响的体外实验研究：术中取无盆腹腔炎症、正常患者的大网膜。用0．25％ 胰酶+O．02％乙二胺四乙酸(EDTA)消化大网膜组织，去除红细胞后培养； 显微镜观察细胞形态变化；HE染色观察细胞形态并计算细胞纯度；扫描 电子显微镜((SEM)观察细胞超微结构；免疫细胞化学法鉴定；粘附、迁移、 侵袭体外实验观察腹膜间皮细胞对卵巢癌细胞生长转移能力的影响。 3荷人卵巢癌细胞裸鼠腹腔移植瘤模型的建立及实验研究：转染质 粒、转染载体和未转染的三种卵巢癌细胞进行体外培养。将裸鼠随机分为 三组，每组各12只，分别将4×106个三种细胞注入每组裸鼠腹腔，自注 入细胞后第二天起，将每组裸鼠又随机分为对照组和处理组，对照组腹腔 内再注入生理盐水，处理组腹腔内再注入CXCR4拮抗剂AMD3100，同 0．2 时每组均腹腔内注射CXCLl2 ml，浓度为lOOng／ml，每2天注射一次， 连用2周共7次。裸鼠自然死亡后，观察腹腔成瘤数、体积、腹水量和存 活期的变化。 结果： 1 稳定表达CXCR4的卵巢癌细胞株的建立与鉴定及其增殖、迁移、 d后转染的卵巢癌 完全一致。②确定G418的筛选浓度为600叫mL。③14 细胞绝大部分死亡形成细胞岛，经有限稀释法获得了数个单细胞，将单细 2 中文摘要 胞进行扩大培养。G418抗性筛选一个月后细胞仍继续生长，转染细胞的 形态和生长速度未发生明显变化，伸展速度较未转染细胞慢。④将获得的 稳定表达CXCR4卵巢癌细胞株通过RT．PCR、Westernblot、免疫细