SARS新型核酸疫苗的实验的研究.pdf

中文摘要 中文摘要 Acute 严重急性呼吸系统综合征(Severe syndmme，SARS)又称 Respira协ry coronavims， 传染性非典型肺炎，是由SARS冠状病毒(SARs_associated 的暴发流行，涉及数十个国家和地区，全球病例高达9096例。目前尚无安全有 效的SARS疫苗。 核酸疫苗是SARS疫苗研究的重点。核酸疫苗不但兼有减毒活疫苗诱导全面 免疫应答和重组亚单位疫苗安全的特点，而且具有研制周期短，生产工艺简单， 成本低等优点，代表了sARs疫苗研发的发展方向。目前sARs核酸疫苗的研究 主要以其结构蛋白s、N和M作为靶标构建重组质粒DNA，免疫小鼠则均可诱 导产生体液免疫应答和细胞免疫应答。但核酸疫苗主要的缺点是免疫原性较低。 为此，本研究对sARS．CoV的S和N基因进行密码子优化，观察其在小鼠 中的免疫原性，并进一步采用原核表达的重组N蛋白与含有N基因的重组质粒 DNA进行联合免疫，分析其诱导免疫应答水平的差异。观察对靶抗原基因密码 子优化以及与重组蛋白联合免疫这两种策略提高sARs核酸疫苗免疫原性的效 果，为研制具有高免疫原性的SARs核酸疫苗提供依据。 白。将扩增产物分别克隆至p、，Axl真核表达载体，获得重组质粒pVsl、pVs2 和pvN。同时对sARs．cov的S基因和N基因进行密码子偏好分析，发现其与 人冠状病毒0c43株和229E株较为相近，但与哺乳动物则差异较大。以哺乳动 至70％和由41％提高至64％，密码子第三位的仔屺％则均提高至100％。将优化 基因人工合成后同样克隆至pwⅨ1真核表达载体获得重组质粒pVes2和pVeN。 中文摘要 免疫荧光法可在细胞胞浆中检测到sARslCov的特异蛋白抗原，表明重组质粒 均可在真核细胞中表达，表达产物具有特异sARs—cov抗原原性。 随后，我们观察了密码子优化对SARS—CoV的S基因免疫原性的影响。首 鼠，共免疫3次。分别采用间接免疫荧光法和中和法测定血清荧光抗体效价和血 清中和指数。结果显示优化的S2基因免疫组(pvcs2)与未优化的s2基因免疫 组(pvs2)荧光抗体差异不显著，但pVes2免疫组的中和抗体水平(免疫后第 90天)则明显高于pvs2免疫组，这说明对s2基因的密码子优化可提高小鼠诱 导特异中和抗体的能力。进一步观察各免疫组小鼠的细胞免疫应答水平，结果显 示pves2免疫组小鼠的脾细胞经灭活sARs病毒刺激后其淋巴细胞转化率(刺激 指数)为11．85士1．54，明显高于其他免疫组。此外，优化s2基因免疫组脾细胞 基因的密码子优化亦可增强其细胞免疫应答水平。 在此基础上，我们进一步观察了密码子优化对N基因免疫原性的影响，同 时探讨了DNA初始免疫．重组蛋白加强免疫途径的免疫增强作用。将含有N基 因和优化的N基因的重组质粒DNA以肌肉注射途径免疫BALB／c小鼠，间隔20 天免疫2次，在第40天以重组N蛋白加强免疫。同时以原核表达重组N蛋白以 颈背部皮下注射途径免疫作为蛋白免疫对照。采用ELIsA法检测小鼠血清抗N 蛋白特异IgG抗体。结果显示，优化N基因免疫组(pveN)较未优化N基因免 疫组(pvN)产生的抗体水平上升快，持续时间较长。如果用重组蛋白加强后则 不论pⅥ．N还是p、咐免疫组的小鼠抗体水平均迅速提升。这表明密码子优化和 重组质粒DNA初始免疫．蛋白加强免疫这两种途径均可有效提高含N基因重组 质粒诱导体液免疫应答的水平。进一步分析细胞免疫应答反应，DNA初始免疫． 重组蛋白加强免疫组脾细胞经重组N蛋白刺激后，其特异cTL杀伤率(66．37％， 组质粒免疫组和单纯N蛋白免疫组。在IFN-Y分泌水平上各免疫组均高于空载体 对照组，但彼此间无明显差异。这些结果表明，密码子优化和重组蛋白加强免疫 这两种途径均可显著提高N基因诱导的细胞免疫应答水平。 2