PCR扩增16srRNA基因以快速诊断败血症及其分型细菌.pdfVIP

摘要 摘要 败血症是细菌进入血液引起的一种严重的全身感染性疾病，病情进展迅速， 病死率高，早期诊断和有效的治疗对病人预后至关重要。目前败血症的确诊主 要依靠血培养结果，但血培养方法阳性率低，耗时长，滞后于临床的需求，导 致临床诊断困难。在治疗方面，由于不能明确病原体，也只能先期应用大量广 谱抗生素治疗，导致耐药性致病菌的增加和病人负担的加重，所以快速诊断败 血症并对细菌初步分型是临床亟待解决的难题。 菌等原核生物中，但不存在于病毒、真菌等非原核生物中。16SrRNA基因高度保 守，但这种保守是相对的，在其保守区之间存在9或10个变异区，可变区和保 守区交叉排列组成，保守区序列在所有细菌菌种中高度一致，而可变区序列则 随菌种的不同有较大的变化。本研究针对16SrRNA基因这一特点，在保守区设 计通用引物，在可变区设计革兰阳性与阴性特异引物，利用PCR技术快速诊断 败血症并对致病菌初步分型，为临床诊治提供病原学依据。 1．败血症的快速诊断 1．1在16SrRNA基因的保守区内设计通用引物，对引起败血症的常见细菌 (金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌、腐生 葡萄球菌)及阴性对照菌(新型隐球菌、白色念珠菌)和乙肝病毒进行扩增。阳 性菌株均得到特异阳性条带，阴性质控未出现阳性条带。 1．2优化聚合酶链反应(PCR)方法并通过不同浓度细菌来检测方法的灵敏 度，PCR方法的最低检测浓度可达到1．5×103CFU／L，显著高于血培养方法。 1．3检测60例败血症患者及20例正常人血液标本中的16SrRNA基因，与血 培养结果进行比较，PCR方法阳性率86．6％，血培养阳性率38．3％，PCR方法 的阳性率明显高于血培养，结果有统计学意义(P0．01)。 1．4随机选取10份血培养阴性而PCR阳性血液标本进行测序，其中8份标 本通过序列比对，鉴定出了标本中的细菌种属。 ． 2．细菌的初步分型 2．1在16SrRNA基因的可变区分别设计革兰阳性菌和革兰阴性菌特异性引． 物，分别对革兰阳性菌株(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、 Il 摘要 肺炎链球菌、化脓性链球菌、肠球菌)和革兰阴性菌(大肠埃希菌、肺炎克雷 伯菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌)进行巢式PCR得到特异性 条带。 2．2对20例血培养阳性血液标本进行检测，得到的结果与血培养鉴定结果 一致。 本研究结果表明，利用PCR扩增16SrRNA基因保守区可以快速诊断败血症， 其阳性率明显高于血培养方法，分别用革兰阳性和革兰阴性引物进行巢式PCR， 可快速鉴定出革兰阳性菌和革兰阴性菌，及时为I临床治疗提供病原学依据。 关键词：PCR；败血症；16SrRNA基因 Ill Abstract ABSTRACT of intothe of diseasecausedinvasionbacteria isakindgeneral by Septicemia bloodstreamand with and progressesrapidlyhi曲mortality．Earlydiagnosis is forthe ofthe attheonsetofdiseases recoverypatients． effectivelytherapy