人支气管干细胞的定位及其性状解析.pdf

中文摘要 目 的 干细胞是指具有自我更新能力及多向分化潜能的细胞。虽然胚胎干细 胞、神经干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、皮肤干细胞、胃肠干细胞 等相继发现，并且造血干细胞已部分应用于临床。但呼吸道中的干细胞尚 为推测中的功能细胞，其定位尚未解决。进行支气管干细胞的定位研究，对 阐明支气管损伤修复的机理、肺癌的组织发生等有重要的理论意义，而且有 自体支气管重建的实用价值，将来甚至可能形成生物医学产业。 本研究应用光镜、电镜、AB—PAS染色、免疫组织化学等方法，于原位 观察人支气管上皮经5一FU损伤后的修复过程，从中发现支气管干细胞。 依赖性外排泵——P一糖蛋白有关，因此本研究还应用流式细胞仪、免疫荧 动态变化及P一糖蛋白的表达情况，进一步进行支气管干细胞的性状解析。 方 法 1．支气管损伤模型的建立取肺癌手术切除的人支气管的正常部分进 行组织培养。平行于支气管环方向将离体人支气管切成2—3mm宽的组织 块，置于含Ham’s F12培养液的培养皿中。实验组：将支气管环置于含5一 Fu浓度为12．52119／ml的Ham’s 箱中孵育，12小时后弃去上述培养液，换成新鲜的Ham’s F12培养液继续 组：应用等体积生理盐水代替5一Fu，其余培养条件及取材时间同实验组。 动态观察5一FU损伤后的修复过程，用免疫组织化学sP法检测此过程中 PCNA，B，一整合素及CK一19的表达。 3．Hoechst33342荧光染色 性。分别取实验组及对照组支气管环，在解剖显微镜下机械剥离支气管上 显微镜观察。 4．流式细胞仪分析分别取正常组及5一Fu作用后的支气管上皮，用 蛋白酶消化法获取支气管上皮细胞悬液，应用流式细胞仪分析： 上流式细胞仪FACScan(Becton 定细胞周期各期细胞百分数； 仪检测。动态观察损伤修复过程中Rhodaminel23阴性细胞所占比例。 5．P一糖蛋白的表达情况取5～FU作用前后的支气管上皮，分别应 用免疫荧光、流式细胞仪及蛋白印迹法分析P一糖蛋白的表达情况。 5’一CCC 一FU处理前后人支气管上皮总RNA，引物序列如下：MDRl一F GG．3’MDRl一R5’一GTFCAAACTTCTGCT ATCATTGCAATAGCA CCT 产物进行2％琼脂糖电泳，相同条件下，用B—actin作为内对照，扩增产物 为690bp，以KodaklD型凝胶自动成像分析系统拍照。 结 果 1．5一FU作用12小时后，人支气管上皮细胞绝大部分脱落，仅见少量 间隔分布的类似裸核的细胞呈钉状位于基底膜上，PCNA染色阴性，证明为 G0期细胞。其中部分细胞Hoechst33342染色阴性。 色阳性的细胞与阴性细胞(G。期细胞)间隔分布；24小时后细胞变为立方， 细胞数目逐渐增多；到48—72小时恢复假复层柱状上皮。 3．p，一整合素及cK一19在已分化细胞中呈阳性反应。 4．透射电镜结果：5一FU作用12小时后人支气管上皮细胞核大，核浆 ·2． 比例增大，细胞器少，未见粘液颗粒。 5．细胞周期分析结果：正常支气管上皮细胞中Go／G，期细胞占活细胞 的86．54 4．95％。 ±3．16％，差异有显著意义。 7．应用免疫荧光法可见：5一FU作用后的支气管上皮细胞涂片上有P 一糖蛋白的表达；流式细胞仪分析：正常人支气管上皮中P一糖蛋白阳性细 的支气管上皮较正常组P一糖蛋白mRNA的表达也有增加趋势。 结 论 1．本研究首次应用5一Fu作为损伤因素，建立了离体人支气管损伤模 型，发现了处于Go期的支气管干细胞，这些干细胞能增殖分化，修复人支气 管上皮。