体外定向进化大肠杆菌β-半乳糖苷酶和农杆菌介导DREB1A基因转化苹果的研究.pdfVIP

全文摘要 体外定向进化大肠杆菌p一半乳糖普酶和农杆菌介导 DREBIA基因转化苹果的研究 摘要 大肠杆菌0一半乳糖昔酶(beta-galactosidase)由源自大肠杆菌(Escherichiacoli) LacZ基因编码。在生物工程领域，0一半乳糖昔酶被广泛使用作为基因遗传转化的 报告基因，检测和筛选转基因受体。 在本研究中，以大肠杆菌LacZ基因作为模板，采用DNAshuffling的体外定向进 化策略，经过三轮DNA改组，结合高效的筛选方法，获得活性提高的突变体。与野 生型的大肠杆菌13一半乳糖昔酶相比，定向进化的13一半乳糖昔酶基因有13个核昔酸 碱基发生变化，结果导致9个氨基酸的改变。以ONPG为底物的酶活测定结果显示， 定向进化的日一半乳糖昔酶的活性相比于野生型，酶比活提高3倍。 DREBIA基因是拟南芥中的一个转录因子，它能与拟南芥中特异性的顺式作用元 件(DRE)上的9bp的保守序列 (TACCGACAT)结合并相互作用，从而调控干旱反应 中基因的表达。 在本研究中，DREB1A基因的克隆是以抽提拟南芥的总RNA，反转录合成cDNA 第一条链为模板，设计并合成一对PCR引物DreBIAZ1和DreB1AZ1，进行PCR扩 增。扩增产物TA克隆后进行序列测定，DNA序列分析结果显示，克隆的DREBIA 基因序列与Genbank登陆的序列一致。在此基础上，构建成DreB1A的植物双元载体 pDreBIA，电击入根癌农杆菌LBA4404e 农杆菌介导苹果遗传转化是建立在优化八棱海棠叶片再生体系和八棱海棠农杆 菌介导的高效遗传转化体系的基础上，优化的苹果再生培养基(MS十BA4mg/L+ NAA0.1mg/L)获得100%的再生率。为了提高苹果的产量和打破栽培区域的限制，以 抗胁迫的DREBIA基因为目的基因，利用农杆菌叶盘法转化受体材料八棱海棠，己 初步获得抗性愈伤和抗性苗。 半乳搪昔酶;体外定向进化;苹果(八棱海棠):农杆菌介导的转化;DERBIA 全文摘要 DirectedEvolutionofEco1iBeta-galactosidaseinvitro and Agrobacterium-mediatedTransformationofMaluewithDREBIA Gene ABSTRACT Ecolibeta-galactosidase,encodedbyLacZgene,iswidelyusedasreportergenewhich wasusedtoscreenthetransformantsingenetictransformation. Inthisstudy,LacZrfomEcoliwasevolvedbyDNAshuffling.ThreeroundsofDNA shufflingandcolonyscreeningonhigh-throughputwereperformed.EvolvedLacZgone hasbeenattained.ComparedwithnativeLacZ,thenucleotidesequenceoftheevolved LacZgeneshowed13basechanges,resultingin9aminoacidchangesrfomthenative enzyme.The purified mutant enzyme showed a 3-fold increasing in o-nitrophenyl-galactopyanosidespecificactivity. DREBIAgeneisatrans-actingfactorinArabidopsis.Itsproteininteractswitha 9-basepair(bp)conservedsequence(TACCGACAT)ofDRE,whichisanessential cis-actingelementforregula