重组家蚕丝素非结晶区肽段的制备和表征.pdfVIP

重组家蚕丝素非结晶区肽段的制备与表征 中文摘要 重组家蚕丝素非结晶区肽段的制备与表征 中文摘要 家蚕丝素有出众的机械性能和生物相容性，近年来越来越多的应用于组织工程支 架材料，家蚕丝素是一种结构蛋白，蛋白空间结构和机械性能取决于它的氨基酸组成 和序列。因此为了更好地控制基于蚕丝的生物材料的力学性能、空间结构、聚集态结 构、降解速率等以适应不同组织支架要求，研制出更理想的材料，及解析其用作生物 材料的生物功能机理，需要系统的研究与分析丝素蛋白组成-空间结构-功能之间的关 系。基因工程技术是系统研究蛋白质结构-功能的一种重要手段。家蚕丝素由重链、 轻链和P25 蛋白组成，重链是主要组成部分，在丝素中扮演了一个非常重要的角色。 重链主要由结晶区和非结晶区组成，采用基因工程技术研究结晶区及类结晶区结构组 装已有文献报导。本文主要研究家蚕丝素重链非结晶区，通过基因工程的方法设计家 蚕丝素重链非结晶区的基因序列，采用微生物表达系统大量制备蛋白、分离纯化, 并 初步对表达产物进行了结构分析，为研究非结晶区序列的生物功能及对重链分子的结 构性能影响提供材料制备方法。 分析并根据家蚕丝素重链非结晶区结构的特点设计了类家蚕丝素非结晶区肽段 基序的编码基因f(1) 。通过基因工程技术首尾相连的方法，对设计的序列进行延伸加 倍，构建了含不同倍数非结晶区编码基因的质粒，分别为F(1) ，F(2) ，F(3) ，F (4), F (8) 和 F (12) 。将各种序列长度基因分别克隆进pGEX-KG 和PET-30(a)两种系列的表达 载体，前者表达产物为His-融合蛋白，后者为GST-融合蛋白。采用DNA 核酸电泳初 步鉴定了克隆质粒和表达载体构建的正确性，并进一步通过DNA 测序表明家蚕丝素 非结晶肽段基因成功地克隆并加倍至 12 倍，以及成功地构建了表达载体，没有发生 任何基因突变和缺失。 将构建的表达载体转染大肠杆菌中诱导获得表达。经过 SDS电泳和 Western 印迹技术分析表明表达载体pGEX-KG 能更好地表达目的蛋白，得到了可溶 性的融合蛋白。本文重点表达了非结晶区基序4 倍和8 倍的多肽，标记为GST-F(4)B , GST-F(8)B 。对两种融合蛋白的表达条件进行了优化，调查了不同诱导剂浓度(0，0.5， 1.0，1.5，2.0 mmol/L)和不同诱导培养时间(2 ，4 ，6，8 h )对GST-F(4)B , GST--F(8)B I 中文摘要 重组家蚕丝素非结晶区肽段的制备与表征 表达的影响，结果表明两种融合蛋白GST-F(4)B 和GST-F(8)B 均在IPTG 浓度为0.5 mmol/L ，诱导时间为6 h 时表达量最高。为收集目的蛋白及定量分析表达效果，总蛋 白采用GST 亲和层析柱进行纯化并用紫外吸收法测定蛋白浓度，定量分析获得的两 种融合蛋白表达量每升菌液最大能达23 mg 和 14 mg 左右。 对GST- F(4)B , GST- F(8)B 进行了氨基酸组成分析，采用Thrombin 酶进行酶切 从GST 融合蛋白中释放出目的蛋白F(4)B 和F(8)B 。Zeta- 电位仪等电点分析结果为融 合蛋白GST- F(4)B 和GST- F(8)B 的PI 在4 和5 之间, 目的蛋白F(4)B 和F(8)B 的PI 在2 和3 之间，实测值与软件预测结果基本符合。采用CD 圆二色光谱对F(4)B 和F(8)B 二级结构进行了初步探索，新鲜制备的溶液中F(4)B 和F(8)B 均主要以α-螺旋为主， 含有少量β-折叠和无规卷曲。采用超声波和恒温振荡诱导F(4)B 和F(8)B 分子自聚集， 结果表明，经过超声波剪切作用，β-折叠结构的含量会有所增加，α-螺旋和无规卷曲 的结构含量下降。恒温诱导自聚集结果相同，α-螺旋和无归卷曲结构含量逐渐减少， β-折叠结构含量有所增加。 关键词：家蚕丝素，非结晶区，基因工程，重组表达，大肠杆菌，蛋白特性，二 级结构