线粒体神经酰胺酶上调K562细胞Bcl2蛋白表达的机制的研究.pdf

!查苎墨 线粒体神经酰胺麓转染K562细胞，通过其下游代谢产物 1．磷酸鞘氨醇，上调抗凋亡蛋白Bcl．2表达水平 摘 要 在20世纪70年代以前，人们认为细胞膜的脂质成分只是一类生 化惰性的结构材料。那时，也有部分报道认为脂质成分很可能是重要 的信号分子。磷酸肌醇循环的发现以里程碑的形式证明了脂质在细胞 信号转导过程中发挥重要作用。在磷脂酶C作用下，磷脂酰肌醇．4，5一 二磷酸(PIP2)发生水解，从其脂质骨架中释放出头部基团1,4，5。三磷 自的信号转导通路。 随后又发现，在磷脂酶A2作用下生成的花生四稀酸和磷脂，也是 重要的脂类第二信使和细胞内效应调节剂。花生四稀酸作为一种前体 物质，生成多种衍生物，每种衍生物都有其特异性的浆膜或细胞内受 体，从而引导信号转导方向，产生特异性细胞反应。 其它的脂质信号分子还包括磷脂酸(磷脂酶D代谢产物)、溶血磷 PKC．‘的作用。 近年来，又发现膜脂质的另一种组分一鞘脂类也是重要的信号分 子。鞘脂类信号分子是鞘脂长链基团衍生物，种类繁多、结构复杂。 哺乳动物细胞表面的糖脂成分，就是糖链基团接合膜鞘脂组成的。 德国人Tudichum首先采用分散结晶的方法，从脑组织的乙醇提取 物中分离出一种天然成分，其分子结构由糖基、脂肪酸和有机质基团 ‘Sphinx’(希腊神话中的狮身人颈像)来形容这种物质具有神秘的分 子结构。 目前，已经鉴定了300余种鞘脂类物质，对其功能、代谢及降解 缺陷性疾病进行了详细的探索。特别是Yasuf．AHannun发现鞘氨醇(鞘 ±查塑墨 ． 脂类代谢产物)具有抑制PKC功能后，鞘脂类作为生物活性分子的认 识激发了人们极大的兴趣。除了鞘脂信号过程及代谢途径外，人们还 对相关的酶学，拓扑学(指细胞内功能定位)及病理生物化学等内容 进行了深入研究。 鞘脂代谢物中具有明确生物活性的分子包括鞘氨醇、神经酰胺和 1．磷酸鞘氨醇；此外，鞘糖基磷酸胆碱、鞘氨醇半乳糖苷、乳糖基酰基 鞘氨醇和脑苷脂可能也有生物活性。 由于神经酰胺在涉及细胞应激反应、衰老及凋亡等多种关键生物 学行为的信号通路的调节方面具有重要作用，因此近十年来对神经酰 胺的代谢和功能进行了深入研究。 酶类。它催化神经酰胺水解，生成鞘氨醇，与神经鞘磷脂酶 作用的最适PH值不同，分为酸性、碱性和中性神经酰胺酶。在鞘氨醇 激酶(分布于胞浆)的作用下，鞘氨醇迅速代谢为1．磷酸鞘氨醇(SPP)。 现在认为，SPP也是一种胞内第二信使，具有动员细胞内储存ca2十、 促进细胞增殖及抑制细胞凋亡等多种作用。 BawabSeta1．JBC 目的：最近，又克隆了一种新的神经酰胺酶(El 胺代谢途径，可能对线粒体的功能特别是抗凋亡功能产生影响。我们 将线粒体神经酰胺酶基因转染到K562细胞，以此了解线粒体神经酰胺 酶细胞生物学效应。 方法：1细胞培养及转染人类慢性粒细胞白血病急变期细胞株 青霉素和100u 积分数为5％的二氧化碳的培养箱中培养，每2～3天传代一次，实验 用对数生长期细胞，台盼蓝染色拒染率均在95％以上。 中文摘要 ll ul及37。C无血 g、T＆‘M．50脂质体13．5 pCDNA3．1／His．CDase质粒3 养瓶(costar)中培养，加入终浓度为800l,t∥ml的G418筛选转染质 粒的阳性细胞株，每3天换液一次，3周后筛选出具有G418抗性的 K562细胞，命名为“K562TC”。 2 集K562TC及K562细胞，以TrizolRNA提取试剂盒提取细胞总RNA， 53℃40s，72℃lmin，扩增35个循环。B2M扩增条件：94℃40s， CDase 5’ T