胰岛素受体底物1和2敲低对猪肝脏细胞糖脂代谢的影响.pdfVIP

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology，2014，34(4)：27—35 DOI：10．13523／j．cb 胰 岛素受体底物 1和 2敲低对猪肝脏 细胞糖脂代谢的影响米 黄天睛 孔庆然 李 妍 于 淼 刘忠华 (1东北农业大学胚胎工程实验室 哈尔滨 150030 2哈尔滨职业技术学院 哈尔滨 150030) 摘要 目的：通过 shRNA干扰高效敲低猪肝脏细胞 中IRS1和 s2基因的表达，进而验证其对于 糖脂代谢相关基因表达的影响，为构建2型糖尿病模型猪奠定基础 。方法：首先通过重叠PCR方 法克隆了猪 IRS1基 因全部的mRNA序列(4814bp)以及通过 3RACE方法克隆了猪 基 因的 部分3非编码 区(3一untranslatedregion，3UTR)。然后 ，通过 Real—timePCR筛选获得 了能显著敲 低这两个基因的shRNA片段，并在 同时敲低 IRS1和 的猪肝脏细胞 中，检测糖脂代谢相关基 因的表达。结果：猪肝脏细胞中IRS1和 s2的表达被显著敲低，分别下降了78％和64％。另 外，糖异生作用酶磷酸烯醇丙酮酸激酶 (phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK)和果糖．1，6． 二磷酸酶 (fructose-1，6-bisphosphatase，F—，6一BP)基因表达显著上升，并导致催化肝脏 中糖酵解 反应的葡糖激酶(glucokinase， )基因表达的显著下降。同时，胆固醇调节元件结合蛋 白(sterol regulatoryelement—bindingproteins，SREBP一)基因的表达也显著上升以及胆固醇调节基 因Abcg8， CYP7al表达明显上调。结论：猪肝脏细胞 中IRS1和馏 基因的敲低可激活糖异生作用，并抑制 糖酵解反应，从而导致糖代谢的异常，同时也能引起脂类代谢的异常。 关键词 5 RNA干扰 糖脂代谢 猪 中图分类号 Q819 根据最新的流行病学研究，糖尿病正在成为全世 以及一定的胰岛素抵抗现象 ，敲除 s2基因的小鼠 界范围内的流行疾病 ，随着人 口老年化趋势，2型糖尿 出生后即表现为胰高血糖症，随时问的增长还会出现B 病的发病率逐年上升…。2型糖尿病 (type2diabetes 细胞分泌障碍 ，而同时敲除IRS1和 52基因的小鼠 mellitus，T2DM)主要的发病机制为外周胰岛素抵抗与 出生前就会死亡 。但是，小鼠模型还是具有很多局 胰腺B细胞功能发生障碍 ，而这些异常大部分是由 限性，小鼠在遗传水平与表型上不能很好地模拟人类 遗传缺陷引起的 。胰岛素受体底物 (insulinreceptor 疾病，而且小鼠寿命较短，不能作为长期患病的研究 目 substrates，IRSs)蛋 白处于胰岛素信号通路的枢纽位 标。作为糖尿病的动物模型，小 鼠对于葡糖 以及胆固 置，通过 自身磷酸化作用招募并结合下游的许多信号 醇食物的反应与人类也存在较大差异 …。 转导分子，将胰岛素信号传递、发散到下级网络，在维 猪和人在解剖学、生理学以及代谢特点方面均有 持细胞正常的生理功能上起到重要的作用 ，IRS1和 很大的相似性，包括心脏血管的功能与结构，脂蛋白的 IRS2基因的缺陷是2型糖尿病的主要发病机制 。有 分布，体型，发胖的趋势以及杂食的习惯等 ，并且患 研究表明，敲除 IRS1基因的小鼠表现出生长发育缓慢 有糖尿病的猪与人显示出共 同的代谢特点与并发症， 因此建立有价值并且稳定的2型糖尿病猪模型是非常 收稿 日期：2014-01-02 修回日期：2014-02．18 国家 “863”计划 (2012AA0