第六章 酶、细胞、原生质体固定化.ppt

Charter 6 Immobilized enzyme and cell 第六章 酶、细胞、原生质体固定化 直接应用酶的不足之处: (1)酶的稳定性差,在温度、pH和无机离子等外界因素的影响下,容易变性失活 (2)酶通常在水溶液中与底物反应，反应结束后，即使仍有较高酶活力，也难于回收利用，成本较高，不便连续化生产 (3)酶反应后成为杂质与产物混在一起,增加分离纯化的困难 答案： 固定化酶 固定化细胞 第一节 酶的固定化 ? 固定化酶是指将水溶性的酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的酶。反应后的酶可以回收重复使用。 固定化酶的优点 ①极易将固定化酶与底物、产物分开; ②可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应; ③在大多数情况下,能够提高酶的稳定性; ④酶反应过程能够加以严格控制; ⑤产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺; ⑥较游离酶更适合于多酶反应; ⑦可以增加产物的收率,提高产物的质量; ⑧酶的使用效率提高,成本降低。 固定化酶存在的缺点 ①?固定化时,酶活力有损失; ②增加了生产的成本,工厂初始投资大; ③只能用于可溶性底物,而且适于催化小分子底物,对大分子底物不适宜; ④与完整菌体相比不适宜于多酶反应,特别是需要辅助因子的反应; 二、固定化酶的制备原则 根据应用目的、应用环境，选择固定化的方法 ，都要遵循以下基本原则 ： ①必须注意维持酶的催化活性及专一性。 ②固定化应该有利于生产自动化、连续化。 ③ 固定化酶应有最小的空间位阻 ④酶与载体必须结合牢固,从而使固定化酶能回收贮藏,利于反复使用。 ⑤固定化酶应有最大的稳定性,所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。 ⑥固定化酶成本要低,以利于工业使用。 1、吸附法 2、包埋法 3、结合法 4、交联法 5、热处理法 1、吸附法 用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法。 固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等; (1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用; (2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落. 2、包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中的固定化方法 多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚酰胺、火棉胶等 常用的包埋剂如：聚丙烯酰胺凝胶。 先把酶与丙烯酰胺单体分散于疏水介质,再进行聚合。 如：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶包埋于丙烯酰胺和丙烯酸中，然后再用羰二亚胺活化载体上的羧基而共价偶联固定。 (2)半透膜包埋法 半透膜：聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几十埃，比酶分子直径小 适用性：底物和产物都是小分子物质的酶 微胶囊：直径一般只有几微米至几百微米。 3、结合法 选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法 重氮法 将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团 叠氮法 含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物 溴化氰法 含有羟基的载体，如纤维素等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物 烷基化法 含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体 4、交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构 特点：此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是不使用载体 双功能试剂：戊二醛、己二胺、双偶氮苯等 第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶 得到一种分子间交联的固定化酶 5、热处理法 在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内 适用性：热稳定性较好的酶的固定化 严格控制好加热温度和时间 固定化酶方法的优缺点比较 二、固定化酶的性质 1、稳定性 2、最适温度 3、最适pH 4、底物特异性 稳定性 比游离酶的好 （1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。 （2）保存稳定性好，保存时间延长。 （3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。 （4）对变性剂(如尿素、有机溶剂、盐酸胍等)的耐受性提高，仍保留较高的酶活力。 最适温度 与游离酶差不多 最适温度(续) 例外 用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，比游离酶高5-10℃; 以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高5-15 ℃ 汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为80 ℃ ，比固定化前提高了30 ℃同一种酶; 用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能不同 最适pH值 酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶—pH曲线常发生偏移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响 底物的特异性 与底物分子量的大小有关; 作用于低分子量底物的酶，没有明