苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白结构和功能及其和20-kb+DNA相互作用的研究.pdf

摘要 苏云金芽胞杆菌(Bacillus 范围最广的杀虫微生物，其杀虫活性主要来源于芽胞形成过程中产生 的杀虫晶体蛋白，研究杀虫晶体蛋白的结构与功能的关系已成为当前 的一个热点。Cryl赢蛋白是目前所知的对鳞翅目昆虫毒性最高和研 究最多的Bt毒素之一。研究表明伴胞晶体中存在与原毒素相互作用 的20．kbDNA片段，同时在活化毒素蛋白中仍然存在。。该片段对晶 体的形成及晶体蛋白在敏感昆虫体内的激活过程可能具有重要的作 用，有关晶体蛋自与20．kbDNA相互作用的机制目前还不清楚。本文 运用生物信息学理论和分子生物学实验技术手段研究了CrylAc5蛋 DNA， 白理论三维结构，分离和纯化了．CrylAc5和与之结合的20．kb DNA相互作用的分子机制，探讨了 研究了CrylAc5蛋白与20-kb 20．kb DNA对CrylAc5蛋自的稳定性和杀虫毒力的影响。主要创新 的研究内容如下： 构建]CrylAc5蛋白理论三维结构，并对模型进行了验证。通过 与已经解析结构的毒素比较，探讨各结构域的生物学功能。CrylAc5 蛋自由3含不同的结构域构成，结构域l位于肽链的N端，为一组由 7个两亲的程螺旋围绕着一个疏水的貔螺旋形成的毡螺旋束，主要参与 细胞膜的穿孔。结构域II位于肽链的中间，为反平行的13折叠片层， 其顶端的突环参与毒素与受体蛋白的结合。位于C端的结构域ⅡI是由 两组反平行的p折叠片层组成的夹心结构，以p果酱卷(jellyroll)拓扑结 构排列。其功能是防止蛋自酶对毒素分子的过度降解。 从本实验室筛选的高毒力的Bt4．0718菌株中分离克隆了crylAc5 无晶体突变株cryB中，高效表达了130kDa的CrylAc5蛋白，采取 DNA， 凝胶层析和阴离子交换层析分离纯化了CryIAc5蛋白和20．kb DNA的相互作用提供了条件。 同时为研究CrylAc5蛋白与20．kb DNA相互作用荧 利用荧光光谱法研究了CrylAc5蛋白与20．kb DNA相互作用不仅与DNA序列有一定关系，而且还与晶体蛋白本身 结构有关系。结合常数K-2．5x109，位点数n1．72。这种结合具有很 强的稳定性。 对CrylAc5与20．kb DNA核苷酸结合的 DNA分子中一段20．bp 分子模拟研究表明CrylAc5蛋白有多个位点与DNA结合。位点 Ser283．Ala284．Gln285、Ser440．Ser441．Ser442 位点 和位点 用识别DNA的特定序列，与碱基直接接触。位点 强的疏水作用。结构域I 酸骨架发生作用形成氢键，结构域II上的Gly339也和与B链磷酸骨 DNA相互作用力包括疏水 架发生作用形成氢键。CrylAc5和20．kb 作用力、范德华力。静电作用力，其中主要作用力为疏水作用力。 研究表明20．kbDNA存在于晶体蛋白中，而不是吸附在晶体表 面，它与晶体蛋白的核心片段结合。稳定性实验表明活化CrylAc5 蛋白与20．kb DNA的体外结合能够增强CrylAc5蛋白对胰蛋白酶处 理的稳定性和在紫外光下的稳定性。室内生测表明，体外活化 DNA结合没有明显地改变蛋白对棉铃虫的毒 CrylAc5蛋白和20-kb 力。说明棉铃虫中肠道可以对含20．kb DNA的CrylAc5蛋白产生合 理的降解。 研究结果不仅有助于了解Bt晶体蛋白的结构与生物学功能，同 时在分子水平上对20．kbDNA与晶体蛋白的相互作用机制以及20．kb DNA对晶体蛋白稳定性和杀虫毒力的