D-二聚体单克隆抗体制备及其在免疫荧光快速定量检测中的应用.pdfVIP

中国医药生物技术 2012年6月第7卷第3期 ChinMedBiotechnol，June2012，Vo1．7，No．3 DOI：10．3969／cmbaj．issn．1673-713X．2012．03．013 · 技 术 与 方 法 · D一二聚体单克隆抗体制备 及其在免疫荧光快速定量检测中的应用 康可人，吴培钿，卢艳华，张健，唐时幸，王继华 D．二聚体 (D．dimer，D．D)是纤维蛋白单体经活化因 箱为美国Thermo公司产品；SDS．PAGE 电泳仪购 自北京 子 XIII作用后形成的交联纤维蛋白凝块，再经纤溶酶水解 六一公司；飞测免疫荧光定量检测仪由广州万孚生物技术有 所产生的一种特异性降解产物，医学应用上将它作为一个特 限公司研制；高速冷冻离心机为 日本 Hitachi公司产品； 异性的纤溶过程标记物，反映纤维蛋白溶解功能l】。与纤维 ACLTOP血凝分析仪为美国 Beckman公司仪器，D．D 检 蛋白破坏有关的疾病，如深静脉血栓形成 (DVT)、肺栓塞 测试剂为西班牙 WerfenGroup产品。 (PE)和弥漫性血管内凝血 (DIC)等，均可导致体内D—D 1．1．3 临床样品来源 自2011年 1月至 6月期间，收 水平升高 】。近年来 D．D 的临床应用范围越来越广，除 集江门市五邑中医院门诊病人血浆 (枸橼酸钠抗凝血，离心 了以上提及的疾病外，在恶性肿瘤、糖尿病、肝脏疾病、脓 收集血浆)，共 106例。D．二聚体含量均经血凝仪定值。 毒血症的诊断以及溶栓治疗监测方面均具有重要的参考价 1．2 方法 值[7-91。 1．2．1 杂交瘤细胞株的建立 取 6～8周龄的 BALB／c 目前 D．D 蛋 白检测方法主要有胶体金法、酶联免疫吸 小鼠，首次免疫将福氏完全佐剂与等体积的 D．D 蛋白乳化 附法 (ELISA)和第二代胶乳凝集法 (免疫比浊法)[1uJ。胶 后于小鼠皮下、足垫处注射，50gg／只，经 3次加强免疫后， 体金法快速简单，但无法实现定量检测；ELISA 法可精确 尾静脉采血，间接 ELISA 法检Nd,鼠血清效价，效价大于 定量，但操作步骤繁琐；免疫比浊法敏感性高，检测结果准 10 的小鼠，腹腔冲击免疫 1次，3d后取其脾细胞制备杂 确，但试剂以进 口为主 】【”。荧光免疫定量检测技术，属于即 交瘤。细胞融合按照常规半固体法进行。将离心好的融合细 时检测 (point—of-caretesting，POCT)Ll]领域的新兴技术， 胞，依次加入 FBS、饲养细胞、HAT溶液、半固体培养基， 能快速、灵敏、简便地实现指标的定量检测，免疫荧光定量 定容至 40ml，置于混匀仪上混匀 30min后，分别倒入 检测技术经过一定阶段的发展，目前主要在感染性指标 (如 30个培养皿中，确保半固体均匀贴皿底，装入湿盒，37℃， C反应蛋白)和心脏标志物指标的应用上较为多见，厂家 5％CO2培养箱中培养。5～7d后，挑选大小适中的单集 以欧美、韩为主。本研究利用杂交瘤技术制备筛选能稳定分 落克隆，转入 96孔板培养，细胞长至培养孔面积 50％ 后， 泌特异性抗 D．D抗体的细胞株，初步应用于免疫荧光定量 用间接法检测细胞上清，筛选高效价的细胞株进行多次亚克 检测平台，实现对 D．D 快速定量检测，为临床相关疾病的 隆，确保细胞株在体外连续传代 3个月和多次冻存后再复 诊断、治疗、监测提供有效工具与手段。 苏仍能稳定分泌抗体。经定株后常规制备腹水，采用小鼠体 内诱生法制备腹水，经正辛酸一饱和硫酸铵法进行腹水纯化， 1 材料与方法 制备单克隆抗体。 1．1 材料 1．2．2 单克隆抗体的鉴定 1．1