大肠杆菌不耐热肠毒素的克隆、改造及其表达.pdf

摘 要 大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin, LT ）是肠产毒性大肠杆 （Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC ）分泌的一种热不稳定肠毒素，LT 是由一个 具有毒性的A亚单位（LTA ）和形成环状的五个能够与神经节苷脂GM1结合而粘附于 真核细胞膜上的B亚单位（LTB ）组成。 能引起人和其他哺乳动物的水样腹泻。LT 除具有毒性外，还能够有效的启动局部及全身的体液和细胞免疫，具有很强的粘膜免 疫原性和粘膜佐剂活性，在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗开发中具有重要医学价 值和经济价值。 为制备大量具有免疫活性的LT蛋白, 本实验通过提取产肠毒素大肠杆菌44815菌 株的基因组，采用PCR方法分别扩增不耐热肠毒素A亚基（LTA ）和B亚基（LTB ）的 编码基因，并将其连接在pMD18-T 载体上，构建成LTA 和LTB 基因的重组载体 pMD18-T-LTA和pMD18-T-LTB 。阳性克隆筛选采用蓝白斑选择和限制性内切酶Xho Ⅰ和Nco Ⅰ消化，最后进行序列测定。然后采用定点突变方法将LTA 的第63位的丝氨 酸改变为赖氨酸，构建成