家蝇抗菌肽基因diptericin的克隆及表达模式分析.pdfVIP

家蝇抗菌肽基因diptericin 的克隆及其表达模式研究 专 业 病原生物学 硕士研究生 杨小蓉 导 师 朱家勇 教授 中文摘要 大多数生物在漫长的进化过程中为了抵御各种有害微生物的侵害，形成了由 多种成分参与的独特免疫防御体系。高等脊椎动物的免疫防御主要靠先天的天然 免疫和后天的适应性免疫，而自然界广泛分布的昆虫则主要靠其天然免疫系统， 即分泌许许多多的生物活性物质，来抵御微生物的侵袭，而这些生物活性物质中 非常引人注目的便是那些广泛存在于真核生物及原核生物体内的分子量小、等电 点高、热稳定性好、抗菌谱广的阳离子肽。它们不仅对G+ - 细菌及G 细菌有杀灭作 用，而且还表现出了抗真菌、抗原虫、抗肿瘤及抗耐药菌株的作用。目前，滥用 抗生素而导致的一些带着耐药性的微生物又卷土重来，新的致病微生物不断出现， 新的抗生素研发跟不上病原微生物的变异步伐，而抗菌肽的出现，无疑为陷入困 境的抗感染治疗带来了曙光；而在农业上研究昆虫的抗菌肽，可以更好地防治虫 害。所以，抗菌肽的研究具有非常重要的价值。 家蝇是双翅目(Diptera)蝇科(Muscidae)昆虫，除了骚扰人、污染食物外，更 重要的是人类多种疾病的传播媒介，传播的病原体有病毒、细菌、原虫等，对人 类危害极大。家蝇携带众多病原微生物而自身并不染病的现象引起了人们极大关 注。本试验室前期曾克隆出一条cecropin 基因（Genbank 登录号：EF175878）， 一条defensin 基因（Genbank 登录号：EF175879），一条attacin 基因（Genbank 登录号：DQ062744），还有一条通过基因芯片技术筛选到的diptericin 片段。 本研究应用末端快速扩增（RACE）技术，基于本试验室之前通过基因芯片 技术筛选到的家蝇抗菌肽 diptericin 基因片段，克隆出了两个差别4 个氨基酸 的全长 diptericin 基因并分别对其进行了相关生物信息学分析；运用实时荧光 1 定量PCR（real-time PCR）及原位杂交技术对其作了时间和空间模式表达研究， 对比诱导前后、不同时间段、不同生长发育阶段 diptericin 基因量表达的变化 进行了分析，并观察了其在家蝇三龄幼虫体内各组织的表达；采用原核表达系统 pGEX-4T-1 分别对其作了原核表达，并用Westernblot 对表达产物作了鉴定。 本研究取得的结果如下： 1、采用不同的RACE 方法，分别运用基因特异性引物和通用引物成功地从免 疫诱导的三龄幼虫中得到了两个全长 433bp 和 468bp 的 diptericin 基因（被 Genbank 成功收录，登录号分别为：FJ748596 和 FJ795370）, 这两个基因具有 完整的编码框,编码 99 个氨基酸。相关生物信息学分析结果表明,其与厩蜇蝇 diptericin A 基因的同源性最高，为77%。并分别对其作了相关生物信息学分析。 2、基于已克隆出的diptericinⅠ基因，设计上下游引物，对未诱导，诱导 后 2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h 的家蝇三龄幼虫进行 real-time PCR。结 果显示：未刺激的三龄幼虫 diptericin 基因表达量非常低，与诱导后2 小时的 相比，差 1 个数量级，诱导后 2h 开始缓慢上升，12h 后达到最高峰，24h 后缓 慢下降，36 小时后回到诱后 2 小时的水平；采用同样的引物对未诱导的家蝇不 同的发育阶段进行了real-time PCR，结果：diptericin 基因在家蝇三龄幼虫的 卵、1龄及2 龄期的表达量非常低，3 龄期达到最高峰。 3、通过应用地高辛标记的diptericinⅠ基因反义RNA 探针，对经多重耐药 性大肠杆菌和耐甲氧西林葡萄球菌混合液刺激前后的家蝇幼虫组织切片进行原 位杂交，结果显示：家蝇抗菌肽 diptericin 基因在诱导后在脂肪体，中肠，气 管，马氏管