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流式细胞仪 上海交通大学医学院 丁磊 副教授 （一）分选的基本原理 488 nm laser + - Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector 四 细胞分选原理 阳性选择 MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分离 阴性选择 1 、分选速度：几千个细胞/秒 2 、分选纯度:99.5%左右 3 、分选收获率:90-95% 4 、分选得率 （二）分选的技术要求 分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞 所占的百分比。 分选收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原 细胞样品中该亚群细胞数的百分比。 数据的显示和分析 一、参数 前向散射光FS: 反映颗粒的大小 侧向散射光SS: 细胞内部结构复杂程度 荧光FL: 细胞被染上荧光部分数量的多少 二、数据的显示方式 （一） 单参数直方图显示 （二） 双参数显示 （三） 三参数显示 以分布直方图( distribution histogram ) 来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是 道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。 纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。 (一) 单参数直方图的显示 Single-Parameter Histogram Displays X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量. (二)双参数数据的显示 Two-Parameter Data Displays 细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot Plot )。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量 参数,在图中每一个点代表一个细胞 1 、点图 双参数点图 双参数点图 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相 同，不同的等高线上细胞数不同。 2 、二维等高图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。 3 、假三维等高图 三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。 (三) 三参数直方图 * * 流式细胞术(FCM)定义: FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。 FALS Sensor Laser 特点: 单细胞的流动的 活细胞的 定量的 多参数的 高统计学精度的 分选细胞 一、 流式细胞仪的分析及分选原理 二、 数据的显示与分析 三、 流式细胞仪分析的技术要求 四、 流式细胞术应用 一 工作原理： FCM是一种在计算机技术支持下的高度 自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。 流式细胞仪的分析及分选原理 1、液流系统 样品流和鞘流 2、光学系统 激光、透镜组、 光电倍增管等。 3、数据处理系统 (一） 基本组成结构 Injector Tip 荧光信号 激光束 Sheath fluid 样品流和鞘流 1、液流系统 流动室 Laser Flow Cell 孔径50-200?m 检测区离喷口200?m 有分选功能 液流驱动系统（示意图） 流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)?V2 (忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。 PMT PMT PMT PMT Dichroic Filters Bandpass Filters Laser 1 2 3 4 Flow cell 激光、透镜组、光电倍增管等。 2、光学系统 E0 E0 E0 E1 E1 E1 吸收 自发辐射 受激辐射 hv hv hv hv hv 当物质受到强烈激励,使某一能级的粒子数大量积聚, 发生粒子数反分布.如有光束入射,入射光子与粒子发生 完全弹性碰撞,使粒子从激发态跃迁到基态同时发生一 个光子.光子的能量与入射光子能量相同,有一致的方向 和恒定的位相关系,这种发射称受激发射. 球透镜和柱面透镜 ： 20×200?m 椭圆形光，短轴和细胞流平行，长 长轴与细胞流垂直。 光束成形与细胞受照方式 激发光焦斑 这种椭圆形光斑的 检测区保证每个细 胞分别受到光照 且受检时受到一致 的光照 FCM的 单细胞照明技术. 光束成形与细胞受照方式 （二） 基本工作原理 单细胞流：流动室 单细胞照明：激光 488 nm laser 488 nm