桦褐孔菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆与定量表达分析.pdfVIP

食用菌学报@2015．22(3)：1～6 DOI：10．16488／j．cnki．1005—9873．2015．03．001 桦褐孑L菌 I]；一葡萄糖苷酶基因的克隆与定量表达分析 隋飞飞 ，陈艳秋 (延边大学农学 院，吉林延吉 133002) 摘 要 ：利用反转录 PCR(reversetranscriptionPCR，RT—PCR)和 cDNA末端快速扩增 (rapid—amplification ofcDNAends，RACE)技术从桦褐孑L菌 (Inonotusobliquus)菌核 中克隆了G一葡萄糖苷酶基 因的全长 DNA序 列 ，命名为 IO-BGL。该 DNA序列全长 3382bp，其 中开放 阅读框 (ORF)长度为 2583bp，含有 13个 内含子和 14个外显子 ，编码 860个氨基酸 ，相对分子量为 93．4kD，等 电点为 5．57，编码的氨基酸序列与地 中海嗜蓝孢 孔菌(Fomitiporiamediterranea)相似性最高 (85％) 采用实时荧光定量 PCR技术研究 IO-BGL基 因在菌核 发育过程中的表达量变化 ，结果表 明，IO-BGL基因在菌核的发育过程 中，表达量呈先上升后下降趋势 。 关键词 ：桦褐孑L菌；内切葡聚糖酶 ；菌核 桦褐 孔菌 (Inonotusobliquus)又称桦 纤孔 研究主要集 中在基 因的克隆和异源表达两个方 菌 、斜生纤孔菌 ，俄语名为 ：Chaga，是一种珍贵 的 面，关于其在微生物的发育过程中作用 的研究较 药用真菌 ，菌核为药用部分_1]，具有增强免疫功 少 。DING[1。等人从草菇 中克隆得到一个 BGL 能 、降血糖和抗肿瘤等多种功效 。桦褐孔菌广泛 基 因，发现其在草菇不 同发 育过程 中均有表达 ， 分布于欧洲 、亚洲和北美洲_2]，在我 国主要分布 并且在子实体形成过程 中表达量逐渐增加 。到 于黑龙江大小兴安岭、吉林长 白山区、内蒙古、河 目前为止，尚未有 BGL基 因在桦褐孑L菌 中克隆 北、山西和陕西 的天然林 内[3-51。 目前桦褐孔菌 和表达的研究报道 。 菌核的人工栽培虽然取得成功 ，但是 由于菌核产 本试验 以桦褐孔菌 JL01菌株为材料 ，利用 量低 ，尚不能进行规模化生产。所 以，提高人工 RACE技术 ，首次克隆得 到 BGL基 因的 cDNA 栽培的菌核产量势在必行。 和 DNA全长序列，利用生物信息学方法对其进 诸多研究表明，纤维素酶活性与子实体的产 行分析 ，并采用实时荧光定量 PCR技术 ，分析桦 量 密 切 相 关 _8_，而 J3．葡 萄 糖 苷 酶 (beta． 褐孔菌菌核形态发育过程中BGL基 因的表达模 glucosidase，BGL)是纤维素酶系的主要组分之 式 ，为深入研究桦褐孔菌菌核形成 的分子机理提 一 ，广泛 的分布于细菌、真菌和许多动植物体 供参考。 内[9]。研究发现 ，BGL参与 EMP糖酵解途径 ， 1 材料与方法 主要是协助其它酶将纤维二糖和纤维素寡糖水 解为葡萄糖 ，对维持生物体的正常生理功能起着 1．1供试菌株 重要作用[1。但是 ，BGL在纤维素酶系 中所 占 桦褐孔菌 (I．obliquus)JL01菌株 由延边大 的比重最少、活力普遍不高，成为纤维素酶活性 学长 白山生物资源与功能分子教育部重点实验 的瓶颈 。因此 ，提高 BGL活性 ，可以有效提高纤 室保存并提供。 维素酶解效率。 1．2主要试剂 目前 ，已有成百上千的 BGL基因得到克隆 ， 普通琼脂糖凝胶