1.2基因工程基本操作程序lk.pptVIP

四、目的基因的检测与鉴定 四、目的基因的检测与鉴定 * 1.2 基因工程的基本操作程序 1）目的基因的获取 2）基因表达载体的构建 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测与鉴定 基因工程的四个基本步骤： 一、目的基因的获取 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 人工合成 目的基因是编码蛋白质的基因。 1.从基因文库中获取目的基因： 基因文库: 基因组文库: 部分基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。 基因文库中包含了一种生物所有的基因. 基因文库中包含了一种生物的一部分基因。如cDNA文库。 2.利用PCR技术扩增目的基因 3.人工合成基因法 基因比较小，核苷酸序列已知。 二、基因表达载体的构建（核心） 1.目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能表达。 2.组成： 目的基因 启动子 终止子 标记基因 3.构建方法 （1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 （2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。 （3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） 二、基因表达载体的构建（核心） 启动子 终止子 标记基因 基因的首端，RNA聚合酶识别、结合部位，驱动基因的转录。 基因的尾端，使转录停止。 鉴别受体细胞是否含目的基因（如抗生素抗性基因） 三、将目的基因导入受体细胞 目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 1.转化 2.将目的基因导入植物细胞 （1）常用方法： 农杆菌转化法 ①农杆菌转化法过程 ②适用： 双子叶植物和裸子植物 ③受体细胞： 植物活细胞 植物组织培养技术 （2）其他方法 基因枪法 花粉管通道法 （适用于单子叶植物） 3.将目的基因导入动物细胞 显微注射技术 (2)转基因动物受体细胞 受精卵或早期胚胎细胞 (1)方法： 4.将目的基因导入微生物细胞 (2)原核生物作为受体细胞的优点 繁殖快、多为单细胞，遗传物质相对较少。 (1)过程 细胞经Ca2+处理成感受态细胞，和重组表达载体混合，完成转化。 (1)转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 1.分子水平检测 方法： DNA分子杂交技术，是否出现杂交带。 1.分子水平检测 (2)目的基因是否转录出mRNA (3)目的基因是否翻译成蛋白质 分子杂交技术，是否出现杂交带 抗原－抗体杂交，是否出现杂交带 2.个体水平的鉴定 如抗虫或抗病的接种实验、基因工程产品与天然产品的功能活性比较 *