大黄欧文氏菌蔗糖异构酶控制产物特异性基序的定点突变.pdfVIP

基因组学与应用生物学，2011年，第 30卷，第 5期，第 556—563页 GenomicsandAppliedBiology，2011，Vo1．30，No．5，556—563 研究报告 A Letter 大黄欧文氏菌蔗糖异构酶控制产物特异性基序的定点突变 周兴 。 韦星明2 杨祥开 2 郑元涛 2 庞浩 许黎 明 黄 日波 1广西大学生命科学与技术学院，南宁，530005；2广西科学院生物研究所，南宁，530007；3生物质能源酶解技术国家重点实验室，广西科学院 南宁，530007 通讯作者，rbhuang@gxas．ac．cn 摘 要 大黄欧文氏菌(Erwiniarhapontici)蔗糖异构酶催化蔗糖异构为异麦芽酮糖和海藻酮糖，具有一个可 能控制产物特异性的 RLDRD 基序。本研究以定点突变方法对该基序的带电荷氨基酸进行突变，共构建 R D、R] 、R弛8D、R3。Q和Dsz9N5个突变体。通过对突变体的酶学特性及突变体转化蔗糖的产物组成分析， 结果显示所构建突变体的Km值上升约2～5倍，比活力下降至野生型sI比活力的11．8％～25．3％。HPLC分析 显示Arg弛和Arg弛分别突变为Asp，导致产物中异麦芽酮糖 ／海藻酮糖的比例从 6．93分别降至0．96和 2．92，并伴随一个未知寡糖出现。Arg弛突变为Ala和Gln同样导致反应产物中海藻酮糖比例上升，异麦芽酮 糖比例下降。但是突变体D。29N反应产物比例没有变化。以上结果表明驼sRLDRD，z基序对大黄欧文氏菌蔗糖异 构酶的酶活具有重要作用，并对酶的产物特异性产生影响。本研究结果将为该酶的作用机理研究奠定基础。 关键词 蔗糖异构酶，定点突变，产物特异性，大黄欧文氏菌 Site--directedMutationinaProduct--Specificity--ControllingMotifofSucrose l■SOmeraSen■’Om E～rwin·ia·rhapontt●c● ZhouXing 。 W eiXingming YangXiangkai ZhengYuantao PangHao XuLiming HuangRibo 1CollegeofLifeScienceandBiotechnology，GunagxiUniversity，Nanning，530005；2BiologyInstitute，GuangxiAcademyofSciences，Narming， 530007；3StateKeyLaboratoryforBiomass EnzymeTechnology，GuangxiAcademyofSciences，Nanning，530007 Correspondingauthor，rbhuang@gxas．ac．cn DOI：10．3969／gab．030．000556 Abstract Sucroseisomerase(SI)fromErwiniarhaponticiisomerizessurcosetoproduceisomaltuloseandtre— halulose．Ithasamotif(弛RLDRD凹)whichmaycontroltheproductspecificity．Inthisstudy，thechargedamino acidresiduesofthemotifhavebeensite．directedlymutated，and5mutants(R325D，R328A，R328D，R328QandD。9N1 wereobtained．Byanalyzingtheenzymaticcharacteristicsofthemutantsandtheproductcompositionofsucrose conversioncatalysedbythemutantswefoundthattheKm ofthesemutantsincreasedbyabout2～5foldsandthe specificactivity decreased to 11．8％-25．3％ thatofwild-typeenzyme．ThereplacementofresiduesArg and Arg3船respectivelytoresidueAspresultedinadecreaseoftheisomaltulose／trehaluloseratiorfom 6．93to0．96and 2．92respectivelyinthereactionproductsandtheemergenceofanundeterminedoligosaccharide