大鼠nelin基因干扰质粒的构建及其体外抑制效果研究.pdfVIP

4 Molecular — … Cardi，赶 hi璺 竺 璺 Q ． ：i 型 ： 2 一 ． 基 础 研 究 ． 大 鼠nelin基 因干扰质粒的构建及其 体外抑制效果研究 王慧 王林 宋莉 叶珏 孟宪敏 【摘要】 目的 构建夫鼠nelin基大【J干扰质粒并对其进行体外抑制效果验证，为研究nelin在心 脏发育、心肌肥厚 、心衰及其它心脏疾病 巾的作用提供有效的研究工具。方法 提取大 鼠心肌组织 RNA，逆转录为cDNA，设计合成含BamHI和EcoR1酶切化点的引物，以大 鼠cDNA为模板PCR扩增 获得 nelin基因，定向克隆人pEGFP—N1—3FIAG载体，洲序验证。以克隆得到的大 鼠nelin基因为模 板，设计合成候选干扰序列 ，业克降至pGCSII,-U6载体 ，获得干扰质粒。以nelin基因干扰质粒和重组 表达质粒共转染 ttEK293T细胞，WesternBlot方法检测干扰效果。结果 成功克隆了大 鼠nelin基凶 并构建丁nelin基因重组表达载伴pEGF’P—N1—3FIAG—rNelin。设计构建的4个干扰质粒 (靶位点分别 为+370—388位，+376—394位，+545—563位，+1206—1224，命名为pGCSII一U6一nelh~siteI，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ) 均可显著降低nelin基 的表达，尤以靶向(+370—388位)位点HpGCSII一U6／nelin—sitel质粒的干扰 效果最佳。结论 本实验构建的大鼠nelin 特异性于扰质粒能从蛋白水平 I：高效特异地抑制ne— Jin基 因表达 ，为进 …步丌展其功能研究奠定 J， 础 ．． 【关键词】 nelin皋 太【J；RN f扰；shRNA；载体构建 TheConstructionandin vitroStudy ofInhibition EffectofshRNA Plasmid targeting ratnelin WANGHui，WANGLin，SONGLi，YE Jue，MENG Xian—min．Corelaboratory，CardiovascularInstitute FuWaiHospital，ChineseAcademyofMedicalScier~：es，PekingUnionMedicalCollege，Betling100037， China A【bstract】 Objective roprovideausefultoolforstudyingthefunctionofnelinduringtheheart development，hypertrophy，heartfailureandotherheartdiseases theRNA—interferenceplasmidstargeting ， ralnelingenewereconstructed．ofwhichsilencingeffectwereevaluatedinthisstudy ． M ethods Apairof primersbasedonhumannelingenewithBamH IandEcoR Irestrictionsiteweredesignedandsynthesized