第一章酶工程概况精品.pptVIP

酶 工 程 （专业选修课） dingsm@mail.ccnu.edu.cn 2014-9-2 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 聚乳酸（H-[OCHCH3CO]n-OH）的热稳定性好，加工温度170～230℃，有好的抗溶剂性，可用多种方式进行加工，如挤压、纺丝、双轴拉伸，注射吹塑。由聚乳酸制成的产品除能生物降解外，生物相容性、光泽度、透明性、手感和耐热性好 生物转化：是指外源化学物在机体内经多种酶催化的代谢转化。生物转化是机体对外源化学物处置的重要的环节，是机体维持稳态的主要机制。 （二）测定原理 无论是临床医学中对酶量的分析，还是在酶的分离提纯过程，或是对酶性质的研究，都需要对酶量进行测定。 根据米氏方程： 可知，如果控制一定的条件，固定底物浓度，则酶反应速度与酶浓度成正比（且只受酶浓度的影响）。以此测得的酶促反应速度可用来定义酶浓度。 所以测定酶量的关键是控制测定反应的条件，排除其它因素的干扰。准确地测定酶促化学反应的速度大小。 （三）酶活力的测定方法 酶活力测定的方法，可以根据具体的条件选择采用化学测定法，电化学测定法、光化学测定法、放射化学测定法、气体测定法……在一个固定的较短时间内测定酶促化学反应产物的增加量或者底物的减少量。 无论采用哪种测定法，必须要考虑以下几个因素。 1．必须测定反应的初速度 2 . 底物 3．PH 4．温度 5．辅助因子 6．酶样品 7．空白和对照 8．测定方法 1．必须测定反应的初速度 以测得产物变化量△P对时间t作图，可获得如图1-1所示的“酶促反应进程曲线”，这条曲线上各点的斜率就代表酶促反应在该点的瞬时速度。 图1-1 酶促反应进程曲线 初速度是指反应时间为零时的极限速度，是酶促反应进程中的最大速度。 酶促反应的各个时间段的速度是不断地变化的. 随着反应时间延长、曲线逐渐弯曲，斜率改变，反应速度下降。那么，应该选用哪一个时间段的速度最能代表酶活力的正确信息呢？只有初速度是一个稳定值，只有初速度才能代表酶活力。 曲线表明只有在反应的初速度阶段底物的减少量或产物的增加量随时间变化是线性增加的，反应速度恒定。但实际上总是要使反应进行足够短的一段时间，这段时间一般指底物消耗不超过5%，五分钟或更短的一段时间。测定初速度的另一个原因是可以避开很多干扰因素，随着反应时间的增加，反应速度会逐渐变小，造成这种现象的因素，包括底物浓度的减小，产物浓度的增加，所产生的逆反应，抑制作用及酶的部分失活，PH的变化等，所以酶活力的正确信息必须通过测定的反应初速度来确定。 2．底物 ①底物种类的选择 一般说来，测定用的底物，应该用酶的最适底物。如测定纤维素酶活力，用纤维素为底物；测葡萄糖氧化酶活力，则以葡萄糖为底物。这些酶，底物无可选择，属绝对专一性。有些酶，表现相对专一性，则选用Km较小的最适底物作为测定用底物。有时,为了便于测定，选用的底物（包括人工合成的底物）最好在物理化学性质上与产物不同。 如，脱氢酶需用NAD(P)+为辅酶，NAD(P)+在340nm处的消光系数很小，而NAD(P)H在340nm有较大的消光系数，因此可以根据反应时340nm吸光度的变化来检则NAD(P)H的生成（或减少）并以此计算酶活。 或者，利用指示剂光吸收的变化： 这里偶联一个反应： 或者，产生气体如CO2；或者，[H+]发生变化……如此等等，反应体系最好随着反应的进行，有明显的、可用于监测的物理化学性质的变化。 ②底物浓度的选择 为了保证酶促反应速度不受底物浓度的影响，为了全部待测酶分子能正常发挥作用，即全部被底物饱和，所以应该使用足够高的底物浓度。 判别的标准是Km。如选用[S]≥100Km， 则 此时测得的初速度，为最大反应初速度。 但有时不能采用高的底物浓度，（如底物有毒性、价贵、溶解度小、抑制酶反应等）则可根据具体条件，通过实验选择一个恰当的底物浓度。并确定在该浓度条件下酶促反应的动力学级别。 有人建议遇上述情况，采用[S]Km（通常采用小于0.1 Km），对于底物来说，成为一级反应，即 为底物的表观一级反应速度常数。 设，在某确定的[S]下测出V， 有定值， 则 Km为定值，∴Vm= ， 此时，同样可消除底物浓度的影响，求出最大反应初速度Vm。 ③所使用的底物溶液应该均匀一致，有一定的纯度，一般要求新鲜配制。 值得注意的是，不是所有的酶反应初速度都与酶活力成正比。为了确定这一点一般可以取三个酶浓度测定反应初速度，如果测定的初速度