核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析精品.pptVIP

主要核酸类药物及用途 主要核酸类药物及用途 DNA酶抑制剂： 金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如：EDTA 阴离子表面活性剂：如SDS。该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。 RNA酶抑制剂： 皂土：带负电荷，能吸附RNase，使其失活。 DEPC(焦碳酸二乙酯 )：通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 EDTA：破坏细胞膜，螯合Mg2+、Ca2+，使DNase失活； SDS：可破坏细胞膜、抑制核酸酶，还可使核酸从蛋白质上游离下来； 蛋白酶K：非特异性蛋白酶，可将蛋白质消化成氨基酸； 65℃：高温下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 冰浴：降低温度使蛋白质及多糖杂质沉淀； 水饱和苯酚：由于蛋白与DNA连结键已断裂，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相。苯酚使蛋白质变性，并抑制了DNase的降解作用。 氯仿：氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，还能去除植物色素和蔗糖。 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相、下层有机溶剂相维持稳定。 无水乙醇沉淀DNA：与核酸不发生任何化学反应；对盐类沉淀少，沉淀中所含微量乙醇易挥发除去。 2.? RNA分离纯化----Trizol一步法 TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。 0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。 注意：Trizol是强腐蚀性物质，小心存放于4℃ (三) 核酸的浓缩 随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物 过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度 会遂渐下降，当不能满足后继研究与应用的需要时， 应对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法。 优点：核酸沉淀后,可以很容易地改变溶解缓冲液和调 整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部 分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。 1．浓度鉴定 (1)紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，其最大吸收波长在250 ~ 270 nm 之间。 在波长260nm紫外光下，1 OD值得吸光度相当于双链DNA浓度为50 μg/ml；单链DNA和RNA为40 μg/ml；寡核苷酸为35 μg/ml。 OD值范围应该在0.1~0.99之间，否则不符合上述线性关系。 (2) 荧光光度法 核酸的荧光染料溴化乙锭(ethidium bromide，EB)嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。该法灵敏度可达1-5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。 另外，SYBR Gold作为一种新的超灵敏荧光染料，可以从琼脂糖凝胶中检出低于20pg的双链DNA。 * 第七章 核酸的分离纯化及鉴定技术 提取核酸的目的: 1.实验研究 2.用于研制核酸类药物及保健品 ? 核酸分离与纯化的设计与原则 相对分子质量较小，含有多核苷酸、多肽化合物，Mr10000；它只传递细胞免疫信息，无体液免疫作用，不致促进肿瘤生长，治疗恶性肿瘤比较安全；亦可用于治疗肝炎等 转移因子（TF） 推动正常RNA分子在基因水平上通过对癌细胞DNA分子进行诱导，或通过反转录酶系统促使癌细胞发生逆分化，如：可用于肝炎治疗的抗乙肝iRNA，治疗肺癌的抗肺癌iRNA 免疫核糖核酸（iRNA） 有抗放射作用，能改善机体虚弱疲劳；与细胞毒药物合用，能提高细胞毒药物对癌细胞的选择性作用；与红霉素合用，能降低其毒性，提高抗癌疗效 脱氧核糖核酸（DNA） 口服用于精神迟缓、记忆衰退、动脉硬化性痴呆治疗；静脉注射用于刺激造血和促进白细胞生成，治疗慢性肝炎、肝硬化初期癌症 核糖核酸（RNA） 治 疗 范 围 名 称 促进体内物质的生物氧化 辅酶Ⅱ（NADP） 用于白细胞减