基因治疗就是将遗传原料导入特定细胞以治疗疾病的一个过程.docVIP

N/P比对转染率和多聚乙酰亚胺/壳聚糖/DNA络合物的细胞毒性有重要影响 为了设计一个兼具PEI和壳聚糖的优点的基因传递复合载体，我们评估了不同N/P比（阳离子聚合物的氨基的摩尔数与DNA的磷酸基团摩尔数的比）组成的PEI/壳聚糖/DNA络合物载体的细胞毒性和转染率。结果显示壳聚糖/DNA结合程度依赖于N/P比。络合物载体的大小主要在100-150nm之间。络合物载体（含N/P=4的壳聚糖/DNA, N/P=10 的PEI/DNA 的PEI/壳聚糖/DNA）的细胞毒性比PEI/DNA低，能维持细胞存活率大于80%，并且具有比单独使用壳聚糖或DNA时高将近1000倍的转染率。而且在Hela细胞和A549细胞中，血清没有抑制带有加强的绿色荧光蛋白的络合载体的转染率。PEI/壳聚糖络合物具有高转染率和低细胞毒性，可能成为有前途的载体。 关键词 壳聚糖 多聚乙酰亚胺 基因传递 细胞毒性 转染率 基因治疗就是将遗传原料导入特定细胞以达到治疗疾病的目的。它有希望通过补偿缺陷基因或产生有益蛋白来治疗多种疾病。在基因治疗中，基因载体充当着很重要的角色。最近，非病毒载体越来越多的被认为是比病毒载体更保险的选择，因为它们有容易合成、瞄准细胞或组织、低免疫反应、不限质粒大小等潜在优势。在非病毒系统中，阳离子聚合物逐渐引起人们的关注，因为质粒DNA和阳离子聚合物之间能容易地形成自凝集聚合高分子电解质络合物，并促成转染，使DNA凝结成毫微粒子，防止DNA被酶降解，还能促进细胞摄取和内容物逃逸。PEI和壳聚糖这两种阳离子聚合物广泛用作基因传递的非病毒载体，它们都有结合细胞表面蛋白聚糖进入细胞和承受细胞吞噬的能力，但摄取之后的转染率是大不相同的。PET被认为是基因传递最有效的阳离子聚合物。它高质子缓冲力导致内颗粒迅速释放，PEI-DNA络合物进入细胞质并随后进入细胞核的传送过程。但是，PEI也有依赖剂量的毒性，特别是大分子量的PEI，这可能就是大分子量的PEI还没有用在人类研究的原因。而壳聚糖没有高缓冲能力，不能及时的从内颗粒中释放出来。壳聚糖在内颗粒中被降解，由于降解产物的积累，细胞膜高渗破裂，之后原料被释放到细胞质内。然后，这些原料被运送至细胞核。因此，壳聚糖在基因传递系统中不论在体外还是体内通常被认为比PEI低效。但它的生物相容性、生物可降解性和高阳离子潜能相对无毒性都是广为人知的。因此，设计一个兼具PEI和壳聚糖两者优点（又有高转染率又低毒性）的络合物是有前途的。 一些小组已经在这个领域报告了试验性研究。其他场合的同位素动态分析研究证明当PEI（10K）与一个水溶性壳聚糖（WSC）或DNA络合物结合，转染率通过质子海绵作用提高了，且存活的细胞没有明显的减少。另一小组用高碘酸盐氧化壳聚糖和低分子量PEI间的亚胺反应设计了一个壳聚糖-PEI嫁接聚合物，收到了很好的效果。但是N/P比（阳离子聚合物的氨基的摩尔数与DNA的磷酸基团摩尔数的比）的影响还不清楚，而N/P比也许是影响细胞毒性和转染率的一个重要因素。先前的研究中所用的PEI具有小分子量，且一直被证明有低细胞毒性。通常基因转移能力和细胞毒性都随PEI分子量的增加而增加。因此没有证据证明与壳聚糖络合可以降低络合物的毒性。 在这项工作中我们调查了N/P比对PEI/壳聚糖/ DNA络合物的特性的影响，实验中我们用到25K的PEI。我们评估了有或没有血清和有或没有最佳N/P比的复合载体细胞毒性的条件下的基因转染率。 原料及方法 原料 壳聚糖（MW 100 kDa）购于Yuhuan生物化学有限责任公司（中国Yuhuan）。PEI（MW 25 kDa）购于Aldrich化学有限责任公司（美国，WI，密尔瓦基）。鹰法修饰胎牛血清(DMEM)和胰岛素是从Gibco BRL(美国，MD，Gaithersberg)获得的。胎牛血清（FBS）购于Sijiqing生物有限责任公司（中国，杭州）。其他所有化学试剂都是分析纯等级。 细胞株 人宫颈癌细胞株（Hela）细胞和A549人类肺腺癌细胞是从种中国科学院，上海生物科学研究院，生物化学与细胞生物学协会获得的。DMEM培养基含10%FBS，37℃，湿度5%,CO2气氛下培养细胞。 质粒DNA 质粒DNA（pGL3和pEGFP-N1）由浙江大学（中国，杭州）传染病协会提供。质粒DNA用大肠杆菌DH5α扩增，用AxyPrep大质粒盒（中国，杭州，Axy基因生物公司）纯化。超螺旋质粒和开环质粒决定用1.0%琼脂糖凝胶电泳纯化，DNA浓度以260nm和280nm紫外线吸收测量。粒度用精蛋白DNA测量。 壳聚糖/DNA络合物的制备 壳聚糖/DNA络合物的N/P比就是壳聚糖的氨基摩尔数与DNA的磷酸基团摩尔数的比。330Da作为每单位DNA的均量用于计算N/P比。壳聚糖的分子量是