针对建立临床用细胞库的脐带间充质干细胞相关生物学特性分析研究.pdfVIP

基于建立临床用细胞库的脐带间充质干细 胞相关生物学特性研究 硕士研究生：冯长江 指导教师：吴旭 摘要 背景：干细胞(stemcells)是指一类具有多向分化潜能和自我更新能力的细 胞，可分为分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞(ES)是全能干细胞， 理论上能分化为各种成体细胞，由于免疫表型发育不完全，可用于异体移植， 但其研究受到伦理学和法理的限制，并且因胚胎干细胞的原始特性，其存在潜 在的致瘤性危险，所以成体干细胞成为目前研究的热点。传统的成体干细胞获 取如骨髓采集及利用细胞因子动员外周血获取干细胞或者脂肪干细胞等都会给 捐献者或患者本人带来一定的风险，而脐带中的干／祖细胞较成人骨髓中的干／ 祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力；脐带中的免疫细胞较为幼稚，功能活 性低，免疫功能不够成熟，处于一种缄默状态，不会触发免疫反应及引起移植 物抗宿主病；脐带中不会有肿瘤细胞；脐带中的干细胞易于分离；脐带潜伏性 病毒和病原微生物的感染及传播几率均相对比较低；费用低；伦理学争议少： 易于保存和运输。人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)在细胞移植、基因治疗、 组织工程中有广阔的应用前景，使之在众多成体干细胞中脱颖而出。hUCMSCs 主要存在于脐带内部中来自中胚层的胶样结缔组织。结缔组织内有闭锁的卵黄 蒂、尿囊、2条脐动脉和l条脐静脉，无毛细血管，脐带血管外富含基质成分， 其营养来自于脐带血管的渗透。血管周围被胶样结缔组织所包裹，为胶质样物 摘要 要成分为透明质酸)。hUCMSCs的鉴定需要符合三个条件：1．细胞在特定的培养 条件下具有可塑性；2．细胞具有特殊的免疫细胞表面标志物(hUCMSCs：CD34 骨细胞、成脂细胞和成神经细胞等方向分化的能力。结合目前国内外的干细胞 相关科研进展情况，hUCMSCs的规范化和大规模的临床应用和科学研究势在必 行，所以干细胞建库的问题就被提上日程。GMP(Good Practice) Manufacturing 级的干细胞建库有利于使其应用规范化和大量应用，这更有利于科学研究和临 床创伤修复组织工程的大规模应用，广大的患者就是未来的受益者。然而干细 胞建库就面临着冻存复苏后细胞活性的改变、各种成体干细胞的比较、选择何 种干细胞等一系列的问题。冻存细胞储存在．196℃液氮中，理论上储存时间是无 限的，但冷冻对各种细胞均会起到破坏作用。目前认为冻存细胞的损伤主要为“溶 质反应”所致，后者引起渗透压和pH值变化导致细胞膜渗漏，复苏时水分进入 也会有所不同。孕妇的年龄也是其中应考虑的因素之一。 蜕皮甾酮(ecdysterone，EDS)又称D．蜕皮激素，最初在昆虫中发现，但 它在植物界的分布更为广泛，并且含量高。现在所应用的蜕皮甾酮主要由植物 中提取。目前所知其作用主要有：1)促进核酸及蛋白质的合成；2)调节糖代 谢；3)调节脂代谢；4)调节基因表达；5)改善免疫功能；6)抗氧化作用；7) 促进缺血区血管的生成和侧支循环的建立；8)促进多种细胞增殖的作用等。在 本课题组的前期对EDS的研究中发现，蜕皮甾酮有刺激人脐静脉内皮细胞的增 殖和分裂，降低肺血管通透性；促进兔皮肤缺损创伤愈合过程，并认为其机制 与蜕皮激素诱导成纤维细胞、上皮细胞以及血管内皮细胞等增殖分化有关；促 进人表皮干细胞增值，促进人骨髓间充质干细胞增值，促进脐带间充质干细胞 增值等作用。蜕皮甾酮的生物多效性提示其对促进细胞的增殖以及干细胞诱导 分化等方面有一定的影响，进行此项研究具有广泛的应用前景。 本实验就其中冻存复苏后细胞的活性及不同年龄母体来源的hUCMSCs的 活性有无差异进行研究，希望为hUCMSCs建库提供理论基础。 II 硕士学位论文 目的：研究体外条件下人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离培养鉴定、 不同浓度蜕皮甾酮(EDS)对hUCMSCs冻存复苏后的生物学活性的影响及不同 年龄组孕妇来源的hUCMSCs生物学活性的比较。 方法：1、hUCMSCs用酶消化法进行分离、