β-lg-cl在胃肠道中稳定性及其对lovo细胞促凋亡分析.pdf

摘要 摘要 linoleic acid，CLA)是--类具有特殊生理活性的多不饱和脂肪酸。 共轭亚油酸(Conjugated 近年来的研究已证实CLA对人体健康有多种益处，例如抗癌、抗粥样动脉硬化和减肥等功效。 体内动物肿瘤实验和体外细胞培养实验表明，CLA能预防结肠肿瘤。CLA摄入后消化吸收过 程中胃部低pH值环境会影响其活性，降低其抑制结肠癌LoVo细胞的活性。 本课题选择了B．乳球蛋白作为载体物质来保护CLA的生理活性。p一乳球蛋白是牛乳清 蛋白的重要组成成分，是由乳腺上皮细胞合成的乳特有的蛋白质。13-LG作为Lipocalin蛋白 家族的成员，其蛋白质分子结构内部有一个特殊的可以与小疏水分子结合calyx结构，且p一 乳球蛋白在体内不易被胃消化，这种耐受低pH，不易降解的特性使其成为口服结肠定位给药 系统中理想的抗肿瘤药物缓释靶向载体之一。 本研宄通过以下四个部分展开： (1)B—LG—CLA复合物的制备及稳定性分析，综合采用热处理和滴定法制备p—LG—CLA复 合物，并通过DelsaNano Czeta(O电位和粒径分析仪检测模拟胃肠道pH环境作用下其粒径大 小和(电位的变化，通过SDS—PAGE电泳检测模拟胃肠道酶环境作用下的稳定性，以此来探 讨13-LG．CLA复合物靶向肠道过程中分子结构的稳定性； (2)LoVo细胞的形态学观察，倒置显微镜下观察不同浓度的13-LG—CLA复合物处理LoVo 细胞后的形态学变化，初步判断复合物是否对LoVo细胞的增殖有影响； (3)B—LG—CLA复合物对LoVo细胞的增殖抑制和促进凋亡作用的研究，用WST一1法检测 细胞增殖抑制率；倒置显微镜观察细胞形态学变化；Hoechst33258荧光染色后在荧光显微镜 下观察凋亡细胞的形态学变化；流式细胞仪检测细胞凋亡率； (4)B．LG—CLA复合物促进LoVo细胞凋亡信号传导机制的研究，JC一1试剂盒检测线粒体 C表达量变化。 blot检测cyt 膜电位的改变；caspase活性检测；western 通过以上研究我们得到了以下结果： (1)将c9。tl 1．CLA逐滴加入到预热到50。C的13-LG溶液中，成功制备出13-LG—CLA复合物， 1-3)， 使用DelsaNanoCzeta(()电位和粒径分析仪检测到3-LG—CLA复合物在胃pH环境下(pH p．LG—CLA复合物的电位处于40mV至16mV之间；在肠道pH环境(pH6．0．7．4)，3-LG-CLA nin左右。SDS．PAGE电泳检测发现在 复合物的(电位均低于-40mV，粒径大小分布在170 模拟胃肠道酶环境作用下13-LG．CLA复合物仅发生轻微的分解。 (2)WST．1法检测13-LG—CLA复合物对LoVo细胞增殖抑制的实验结果表明：同一药物浓 度的处理组随培养时间的延长对Lovo细胞增殖的抑制率增强，同一作用时间下随着药物浓 度梯度增加对Lovo细胞增殖的抑制率显著增强。 (3)通过光学显微镜和荧光显微镜镜检LoVo细胞形态学变化发现：13-LG—CLA复合物不 同浓度，不同作用时间下，LoVo细胞均出现典型的凋亡形态，流式细胞仪检测细胞凋亡率 发现不同浓度的[3-LG—CLA复合物处理组与对照组相比细胞凋亡率显著增加。 (4)JC．1试剂盒检测发现LoVo细胞在不同浓度的D．LG—CLA复合物作用下线粒体膜电位 C的含量 有不同程度的降低，同时检测发现caspase的活性有不同程度的提高，线粒体中Cyt 东北农业大学工学硕士学位论文 C蛋白有所增加。 有不同程度的下降，相应的，胞浆中Cyt