bacillu sp.el31410弹性蛋白酶发酵条件优化及分离纯化研究.pdf

摘 要 摘要 弹性蛋白酶是一种以水解不溶性弹性硬蛋白为特征的广谱蛋白水解酶。可以由动物 胰脏提取，也可以由微生物发酵法生产。弹性蛋白酶可以作为治疗高血脂症、防治动脉 粥样硬化症等的生化药物；在食品工业中主要作为肉类嫩化剂，此外在动物蛋白水解、 高级保健化妆品等方面均有应用。 本文以本实验室保藏的高产弹性蛋白酶菌株Bacillus 蛋白酶为研究对象，采用优化的发酵培养基进行了5L发酵罐分批发酵工艺条件优化， 并利用70L发酵罐完成了中试试验，从发酵液中纯化出弹性蛋白酶并研究其酶学性质， 筛选并优化出提高弹性蛋白酶热稳定性的安全复合保护剂，估算了弹性蛋白酶的贮存寿 命，对双水相体系纯化弹性蛋白酶也进行了研究，还探讨了菌源性弹性蛋白酶水解丝素 蛋白的能力。主要结论如下： 1)在5L发酵罐内应用好氧微生物培养技术进行分批发酵，研究其培养过程的特 性．进行相应地动力学分析，建立了最适培养策略。温度对弹性蛋白酶分批发酵影响是 明显的。37℃培养很适合该芽孢杆菌早期生长，当置于30℃培养时弹性蛋白酶酶活力 最大。通过比较四种不同的温度培养模式后发现，30℃培养非常适合Bacillussp． EL31410生产弹性蛋白酶。通过比较不同恒定pH进行Bacillus 6．5和7．0时，细菌 程发现，pH对细胞的生长和弹性蛋白酶的合成影响很大。在恒pH 的生长情况都较好。恒定pH7．0获得弹性蛋白酶活力值最高。提出了分段控制恒定pH 6．5，24 7．0，经验证，最大酶活力为699U／mL， 策略，即0到24h恒定pH h后恒定pH 48 h达到产酶高峰。采用分段控制恒定pH策略，保持通气量不变，将搅拌转速由300rpm 提高到400 rpm，泡沫仍然能够控制，细胞的生长和产酶情况良好．并且在保持最大酶 h。 活力相当的情况下，发酵周期提前6 2)根据5L发酵罐分批发酵的发酵1：艺参数进行合理放大，调整后的70L发酵罐 分批发酵参数为：培养温度30℃，通气量为1wm。搅拌转速为230 rpm，发酵过程中 L罐发酵结果接近，在培养33h进入产酶高峰期， 采用分段控制pH策略。发酵结果与5 酶活力达到645 VII 摘 要 物消耗动力学规律，所采取的动力学模型均能很好地拟合了实验数据。建立的动力学模 型如下： … ， 生0．180(1-dt 南9 77虹 dp：一生+4．278x (2) 斑dt 一竺：0．030堡一7．53x (3) 出 田 3)Bacillus 50离子交换柱层析 sp．EL31410发酵液经分级盐析、DEAESephadexA 100凝胶过滤柱层析，得到了纯化的弹性蛋白酶。SDS结果表明， 和SephadexG 该纯化后的产物为清晰的一条带，分子量为31820Da。纯化后弹性蛋白酶酶学性质研究 7-8范围内稳定性最好；有些离子在低浓度时，对 适反应pH为8．2，弹性蛋白酶在pH 弹性蛋白酶有维持稳定和激活作用，如钙离子、钾离子等；而其他离子均表现了不同程 度的抑制作用；还比较了该弹性蛋白酶对不同蛋白水解情况，弹性蛋白酶对弹性蛋白(可 溶性)水解能力最强，对血红蛋白、可溶性丝素(分子量大于10