产黄曲霉毒素菌的检测方法及产毒条件的研究.pdf

产黄曲霉毒素菌株的检测方法及其产毒条件的研究 摘 要 黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，具有致癌、致 畸、致细胞突变的“三致”作用，一直都受到各国的关注；其中寄生曲霉的所有菌 株都能产生黄曲霉毒素而黄曲霉只有部分菌株能产生黄曲霉毒素；据FAO报道， 全球每年约有2596的农作物遭受霉菌及其毒素的污染，约有2％的农作物因污染严 重而失去营养和经济价值。但国内外研究的焦点主要集中在黄曲霉毒素的检测方 法，而对产黄曲霉毒素菌株检测的方法报道较少；传统的微生物检测方法费时、 费力而且容易出现假阴性结果，给检测带来误差。目前对于被黄曲霉毒素污染的 粮食只是被动地采用减毒化处理，并没有真正从产毒菌株这一源头上进行有效防 控，其主要原因在于对毒素产生菌的产毒机制、产毒条件和毒素积累规律缺乏深 度了解，缺少可用于指导防控实践的理论依据。 本文研究了3种不同的方法检测产黄曲霉毒素的菌株，同时对产毒菌株的产 毒条件和毒素积累规律进行了摸索，实验模拟了粮食储藏环境，确定产毒的最优 条件和最低条件，通过对黄曲霉产毒条件和毒素积累规律的研究不仅可以确定影 响毒素产量的主要环境因素，而且还可以预测出在自然环境中菌株的产毒情况， 从而为揭示其产毒机制并进一步制定出相应的防控措施提供依据。主要研究结果 如下： 1．在毒素提取方法上参考中华人民共和国国家标准并加以改进，确定了发酵 液中黄曲霉毒素的提取方法，采用免疫亲和柱法进行纯化处理实现了黄曲霉毒素 的有效分离并减少了其它毒素的干扰；再经过柱后电化学衍生增大荧光强度进行 荧光检测，实现快速、准确检测黄曲霉毒素；因此可以定性、定量的检测产黄曲 霉毒素菌株。 2．利用环糊精可以增强黄曲霉毒素荧光强度这一特性，在普通霉菌培养基 中添加p一环糊精和Mp一环糊精，在本实验条件下，通过对p一环糊精和MB一环糊 精作用效果、添加浓度的比较，确定了M13-环糊精添加浓度为69／L时对增强黄 曲霉毒素荧光效果较好；同时，对Mp一环糊精增强黄曲霉毒素荧光的特异性做了 分析，结果表明MB一环糊精只能增强黄曲霉毒素的荧光性。该方法在普通霉菌培 养基上都适用，这与传统的检测方法相比要简单、快速，且节省人力、物力。 IV 3．通过对黄曲霉毒素合成过程中重要的几个结构基因的筛选，发现aflO、 ariD和aflP这三个基因是黄曲霉毒素合成过程中的关键基因，这三个基因同时表 达的菌株经HPLC检测都是产黄曲霉毒素菌株，因此可以通过RT．PCR的方法检测 这三个基因是否同时表达可以推断出该菌株是否是产毒菌株或其是否具有产毒 的可能性。 4．通过正交试验确定了产毒菌株的最适产毒条件和最低条件；实验利用温 度、PH、转速来模拟粮食的储藏环境，实验表明，通过控制改变储藏环境条件来 控制产毒菌的产毒是一个高效易行的方法；储藏环境中的通风条件，储藏环境温 度和储藏物的pH对菌株的产毒影响重大，较低的温度和良好的通风，即一个凉 爽干燥的储藏环境，加上弱碱性的条件pH值可以很好的降低毒素的产量。 5．本文同时还对黄曲霉菌株和寄生曲霉菌株的毒素积累规律做了研究，在 最优培养条件下，黄曲霉毒素的产生量在短时间内迅速增加；通过对黄曲霉产毒 条件的研究不仅可以预测出在自然环境中菌株的产毒情况，而且还可以确定影响 毒素产量的主要环境条件等，从而为揭示其产毒机制并进一步制定出相应的防控 措施提供依据。 关键词：产黄曲霉毒素菌株；HPLC；甲基化B一环糊精；RT-PCR；毒素积累规律 V of ontheDetermination Study Aflatoxin-·Producing theConditionsof Strainsand Aflatoxins Aspergillus Production Abstract Theaflatoxinsaresecond met