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动物性食品源金色葡萄球菌的耐药分析及blaz、meca和nuc基因的多重pcr检测
摘 要
近年“食品中耐药细菌的危险性引起重视,关于食源致病菌的耐药性的研
aureus,简称SA)已在食品中广泛存在,尤其养殖业中大量使用抗生素,动物
性食品极易成为耐药细菌的“蓄水池。因此本实验从四川省7个地方采集了猪
肉、牛奶、牛肉、鸡肉和鸡蛋等动物性食品样品,以分析其中SA的污染情况,
调查四川动物性食品源SA的耐药性,并建立多重PCR方法快速检测SA对D.
内酰胺类抗生素的耐药基因,侧重检测耐甲氧西林的SA(MRSA)。
1.动物性食品源SA的分离鉴定自2006年12月至2007年9月共采集样
品2560份,参照GB和《葡萄球菌属细菌生化鉴定编码(TH.16S)》,利用选
择性培养基和生化实验等常规方法对SA进行了分离鉴定。用Baird.Parker平板
初步筛选分纯获得疑似菌株118株,根据科玛嘉SA显色平板菌落特征,涂片染
色镜检,溶血现象和血浆凝固酶等实验结果,依GB判定其中108株为SA,依
据TH.16S中葡萄球菌双歧索引判定,凝固酶阳性的113株均为SA,而依据16
项生化实验结果仅有76株菌株鉴定为SA。从污染情况来看,生牛奶中的分离率
低。四川地区动物性食品源SA的生化表型复杂且存在一定差异,常规的表型分
析具有一定缺陷。各个地方各类样品中SA污染情况有一定差异,与其它报道相
比,四川省生肉、生奶和鲜蛋中SA的分离率较低。
2.动物性食品源SA的耐药性分析采用美国临床实验标准委员会
床常用抗生素(组合)的敏感性实验。结果:SA对青霉素G(93.81%)、氨苄西
林可霉素、红霉素、阿奇霉素和四环素耐药率在41.59%--一47.79%;对庆大霉素、
卡那霉素、替米考星的耐药率在21.24%一--29.20%;对氯霉素、达氟沙星和环丙
沙星耐药率较低(2.65%--一7.08%);所有菌株均对苯唑西林,头孢类(先锋唑
啉、头孢曲松、头孢噻呋),阿米卡星,强力霉素,喹诺酮类(恩诺沙星、洛美
沙星、诺氟沙星)敏感;共产生了47种耐药谱;SA可耐受药物的种数最少2
种;主要对青霉素类、磺胺类和大环内酯类表现出多重耐药。四川省动物性食品
源SA耐药情况与其它地区的差异不明显,没有检测出MRSA。研究结果可以作
为兽医用药的参考,也为食品源SA耐药性的安全评价提供了依据。
另外,113株凝固酶阳性SA中49.56%的菌株表现出p.内酰胺酶活性。对
68株多重耐药的菌株进行了苯唑西林(OXA)梯度浓度药物诱导,当药物浓度
OXA的4%NaCl
达5肛g/mL时,获得8株耐药菌SCll一SCl8。用含有6I.tg/mL
有待通过基因分析验证。
5设计了3
因n/dc,p.内酰胺酶基因blaZ和甲氧西林耐药基因mecA,利用Primer
对特异性引物,通过实验条件的优化成功建立了分析SA耐p:内酰胺类抗生素的
787bp(blaZ)和1459bp(mecA)的目的片段。
应用这套多重PCR方法对从样品中分离的79株菌株进行了检测。结果:
耐热核酸酶和凝固酶在内的鉴定方法的符合率达97.47%,与生化鉴定的符合率
为75.95%;blaZ扩增结果与D.内酰胺酶实验和对青霉素类的敏感性分析结果的
分析结果为今后食源SA的鉴定和耐药性快速分析提供了参考。
株SCl6 OXA诱导后的菌株SCl6.8、
nuc+、blaZ+、mecA-,而8、10、12、1699/mL
来源还有待进一步研究证实。其它7株菌诱导前后扩增结果相同。
PCR
对标准菌ATCC33591的nuc、blaZ、mecAPCR产物和SCl6—8的mecA
产物进行了克隆及序列测定,片断大小均与软件设计的相应片断大小一致。对基
因序列和相应氨基酸序列比对分析表明同源性很高。将测定的序列在GenBank
关键词:金黄色葡萄球菌;动物性食品:鉴定;耐药性;苯唑西林;多重PCR
II
Abstrac
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