动物性食品源金色葡萄球菌的耐药分析及blaz、meca和nuc基因的多重pcr检测.pdfVIP

摘 要 近年“食品中耐药细菌的危险性引起重视，关于食源致病菌的耐药性的研 aureus，简称SA)已在食品中广泛存在，尤其养殖业中大量使用抗生素，动物 性食品极易成为耐药细菌的“蓄水池。因此本实验从四川省7个地方采集了猪 肉、牛奶、牛肉、鸡肉和鸡蛋等动物性食品样品，以分析其中SA的污染情况， 调查四川动物性食品源SA的耐药性，并建立多重PCR方法快速检测SA对D． 内酰胺类抗生素的耐药基因，侧重检测耐甲氧西林的SA(MRSA)。 1．动物性食品源SA的分离鉴定自2006年12月至2007年9月共采集样 品2560份，参照GB和《葡萄球菌属细菌生化鉴定编码(TH．16S)》，利用选 择性培养基和生化实验等常规方法对SA进行了分离鉴定。用Baird．Parker平板 初步筛选分纯获得疑似菌株118株，根据科玛嘉SA显色平板菌落特征，涂片染 色镜检，溶血现象和血浆凝固酶等实验结果，依GB判定其中108株为SA，依 据TH．16S中葡萄球菌双歧索引判定，凝固酶阳性的113株均为SA，而依据16 项生化实验结果仅有76株菌株鉴定为SA。从污染情况来看，生牛奶中的分离率 低。四川地区动物性食品源SA的生化表型复杂且存在一定差异，常规的表型分 析具有一定缺陷。各个地方各类样品中SA污染情况有一定差异，与其它报道相 比，四川省生肉、生奶和鲜蛋中SA的分离率较低。 2．动物性食品源SA的耐药性分析采用美国临床实验标准委员会 床常用抗生素(组合)的敏感性实验。结果：SA对青霉素G(93．81％)、氨苄西 林可霉素、红霉素、阿奇霉素和四环素耐药率在41．59％--一47．79％；对庆大霉素、 卡那霉素、替米考星的耐药率在21．24％一--29．20％；对氯霉素、达氟沙星和环丙 沙星耐药率较低(2．65％--一7．08％)；所有菌株均对苯唑西林，头孢类(先锋唑 啉、头孢曲松、头孢噻呋)，阿米卡星，强力霉素，喹诺酮类(恩诺沙星、洛美 沙星、诺氟沙星)敏感；共产生了47种耐药谱；SA可耐受药物的种数最少2 种；主要对青霉素类、磺胺类和大环内酯类表现出多重耐药。四川省动物性食品 源SA耐药情况与其它地区的差异不明显，没有检测出MRSA。研究结果可以作 为兽医用药的参考，也为食品源SA耐药性的安全评价提供了依据。 另外，113株凝固酶阳性SA中49．56％的菌株表现出p．内酰胺酶活性。对 68株多重耐药的菌株进行了苯唑西林(OXA)梯度浓度药物诱导，当药物浓度 OXA的4％NaCl 达5肛g／mL时，获得8株耐药菌SCll一SCl8。用含有6I．tg／mL 有待通过基因分析验证。 5设计了3 因n／dc，p．内酰胺酶基因blaZ和甲氧西林耐药基因mecA，利用Primer 对特异性引物，通过实验条件的优化成功建立了分析SA耐p：内酰胺类抗生素的 787bp(blaZ)和1459bp(mecA)的目的片段。 应用这套多重PCR方法对从样品中分离的79株菌株进行了检测。结果： 耐热核酸酶和凝固酶在内的鉴定方法的符合率达97．47％，与生化鉴定的符合率 为75．95％；blaZ扩增结果与D．内酰胺酶实验和对青霉素类的敏感性分析结果的 分析结果为今后食源SA的鉴定和耐药性快速分析提供了参考。 株SCl6 OXA诱导后的菌株SCl6．8、 nuc+、blaZ+、mecA-，而8、10、12、1699／mL 来源还有待进一步研究证实。其它7株菌诱导前后扩增结果相同。 PCR 对标准菌ATCC33591的nuc、blaZ、mecAPCR产物和SCl6—8的mecA 产物进行了克隆及序列测定，片断大小均与软件设计的相应片断大小一致。对基 因序列和相应氨基酸序列比对分析表明同源性很高。将测定的序列在GenBank 关键词：金黄色葡萄球菌；动物性食品：鉴定；耐药性；苯唑西林；多重PCR II Abstrac