rnai调控玉抗甘蔗花叶病毒和粗缩病毒的研究.pdf

摘 要 玉米是重要的粮食、饲料与工业原料作物。目前我国玉米的种植面积呈逐年 增加的趋势，但玉米病害尤其是玉米的矮花叶病和粗缩病成了限制我国玉米生产 发展的巨大障碍，造成玉米的大量减产和品质下降。利用基因工程技术培育推广 抗病品种和寻找新方法己成为病毒病防治的迫切需求。RNA干涉作为一种特异、 高效的反向遗传学手段，在植物的抗病毒育种中表现出了巨大的优势，成为植物 抗病毒基因工程的热点。为进一步筛选和建立病毒印基因dsRNA的原核表达体 系和遗传转化体系，探讨RNAi技术在玉米抗病毒基因工程中的应用效果，建立 玉米砌蛆i的分子育种新方法。本文利用大肠杆菌HTll5高效表达甘蔗花叶病 毒印基因dsRNA，较系统地研究了外源dsRNA抗甘蔗花叶病毒RNAi调控技术； 构建了兼抗甘蔗花叶病毒及粗缩病毒印基因的RNAi复合表达载体，开展农杆 菌介导的玉米原位转化，并对转化株进行了分子确证，在此基础上对转化株RNAi 效果和抗病性进行了分析，获得了如下主要结果： 1、根据甘蔗花叶病毒印基因序列设计特异性引物，RT-PCR扩增甘蔗花叶病毒 印基因特异性干涉片段，构建印基因反向重复原核表达载体LMCP。利用 IPTG进行诱导表达并对诱导表达条件进行优化。结果表明，经过IPTG诱导， LMCP在大肠杆菌HTl15(DE3)菌株中可表达产生预期大小的片段，经 DNaSe I和I矾aseA消化处理，证实为dsRNA。同时DTG浓度为 O．4~0．6I眦ol／L，诱导表达4h，dsRNA的表达量最高。 2、利用大肠杆菌表达的dsRNA提取液处理玉米8112植株，并对处理参数进行 了优化，结果表明当ds鼬峪稀释1／5浓度以下时处理效果明显；dsRNA喷 洒后3d内接种病毒，抗病毒侵染效果最好：另外，加入适宜浓度的渗透剂 能提高dsRNA的抗病效果。 3、RT．PCR分别扩增甘蔗花叶病毒和粗缩病毒外壳蛋白基因特异性INA干扰 片段，分别构建成反向重复序列并串联在一起，再与抗除草剂施，一基因分别 插入到pDTBU的两个T．DNA区段，构建了兼抗甘蔗花叶病毒和粗缩病毒的 IⅢA干涉复合表达载体pDTBusM。并通过冻融法将该载体直接导入农杆 菌，获得了经PCR鉴定的转化子，用于农杆菌介导的玉米原位转化。 SM 4、利用农杆菌介导的原位转化技术将印基因I埘A干涉表达载体pDTBU 转入玉米8112自交系，对To代植株进行除草剂Basta筛选，结合PCR扩增 筛选得到19株共转化植株，对Tl代共转化株系进行PCR检测及So硼lem 杂交分析，证明有3个株系发生了分离，且获得了整合有甲基因RNAi片段 的转化株。 5、提取Tl代不同转化株的叶片总RNA以及开花期不同器官的RNA，经反转录 反应后，进行荧光定量检测印基因在不同转基因植株以及在同一转基因植 株不同器官中的表达量，结果表明转化的印基因干涉片段在不同转基因植 株中的表达量不同。目的基因在雄花和叶中的表达量最高，而在根中的表达 量最低。 6、T：代转基因玉米植株4叶期时接种甘蔗花叶病毒，并于接毒后不同时间提取 叶片总RNA，荧光定量检测外源病毒诱导对内源印基因表达的影响，结果 表明转化的印基因干涉片段对甘蔗花叶病毒产生了干涉效应，转入的印基 因RNAi片段在转基因植株中能正确转录，并导致印基因mRNA含量的交 替变化。 d、21d、30d取 7、对T2代4叶期转基因玉米接种甘蔗花叶病毒，于接毒后14 叶片，ELISA检测植株的发病情况，结果表明，不同转化株株系的感病情况 有差异，但抗病性均不同程度地高于对照。 综上所述，本文利用细菌高效表达的dsIⅢA处理玉米8112自交系，通过对 处理植株的发病情况进行研究，筛选并建立了外源dsRNA的干扰调控技术体系； 成功构建了兼抗两种病毒的无选择标记IⅢAi复合表达载体，利用农杆菌介导的 玉米原位转化技术，获得了整合印基因的RNAi转化株，其RNAi效果显著， 转化植株的抗病性得到了提高。其研究结果对建立RNA干扰调控技术体系在玉 米抗病毒基因工程中的