利用sb401pta基因同时改良水稻的蛋白质品质和抗虫特性.pdfVIP

摘要 sativa 水稻(OryzaL．)是世界上最重要的粮食作物之一，我国一半以上人13以 稻米为主食。但水稻虫害的发生有时是灾难性的。据统计，如果不打农药，水稻每年 因虫害造成的产量损失可达83％，而稻匕虱是为害水稻最严重的虫害之一，所以防治 稻飞虱是增加产量的重要途径。化学农药的使用虽然能在某种程度上减少稻飞虱为害 引起的损失，但同时又带来了诸如污染环境、危害人类健康等更为严重的问题。基因 工程技术的出现和发展，为人类防治包括稻飞虱在内的水稻害虫提供了一条新的思 路。 作为大多数人的主粮，水稻的高产稳产是人们首先所关注的。随着生活水平的提 高，人们对稻米营养品质的要求也越来越高。其中，蛋白质和必需氨基酸是人们首先 关注的营养特性。但是，水稻种子中蛋白质含量仅占粒重的5～10％，赖氨酸仅占蛋 白质的3．5～4．0％，是第一限制性必需氨基酸。缺乏赖氨酸，会造成人体代谢紊乱，甚 至引发某些生理机能性疾病。可见，稻米中赖氨酸的含量与以稻米为主食人群的健康 息息相关。因而提高稻米中赖氨酸含量从而改良稻米蛋白质品质是水稻育种的重要目 标。 利用传统育种手段或通过将含有不同外源基因的转基因植株进行有性杂交皆可 同时改良水稻的抗虫特性、蛋白质品质等农艺性状，但两种方法的缺点都是育种周期 长，见效慢。而将控制不同农艺性状的多个基因构建在同一载体的同一T-DNA上， 导入目标水稻中，是同时改良水稻多个目标性状的一条有效途径。本研究利用农杆菌 介导法，将构建在同一载体T—DNA上并分别由玉米泛素基因启动子Ubi和水稻胚乳特 异表达启动子PGlu驱动的半夏凝集素抗虫基因(pta)和富含赖氨酸的马铃薯花粉特 异水溶性蛋白基因(sb401)导入两个水稻品种中，其主要成果如下： 1．来源于粳稻日本晴和籼稻恢复系501R幼胚诱导的愈伤组织与农杆菌 伤中共获得155块抗性愈伤(日本晴90块，501R65块)，抗性愈伤率分别为63．38％ 和16．88％。抗性愈伤经分化培养，共获得70株独立转化的再生植株，PCR检测筛选 出18株阳性苗，其中，日本晴13株，501R5株，转化率分别为9．15％和1．30％。 2．随机抽取2株经PCR鉴定为阳性的植株和一株未转化植株提取总DNA进行 Southern blotting分析，结果显示未转化植株无杂交条带，而转化阳性植株则1-2个拷贝 说明目的基因sb401和pta已经共整合到受体水稻基因组中。 3．提取2株的Southern 植株的总RNA，进行胛基因RT-PCR检测。发现所有3株阳性植株均扩增出与目的 得到了表达。 4。随机抽取10株PCR鉴定为阳性、且结实比较多的日本睛T0代转基因植株的 成熟种子用于总蛋白质和赖氨酸含量的测定(每株选取15¨200粒种子)。随机抽取 4株非转基因日本晴植株，每株选取50粒成熟饱满的种子混合作为阴性对照。结果 显示大部分植株种子的总蛋白和赖氨酸含量都有不同程度的提高，其中8号样品的种 转基因植株中的翻译水平上得到了比较有效的表达。 5．从10株已测定总蛋白和赖氨酸含量的To代转基因植株中，每株选取60粒种 子，平均分成3组即分3次重复进行Hyg抗性发芽实验。以未转化种子作为对照。 结果表明大多数植株种子的Hyg抗感分离比符合3：1，遵循孟德尔单基因显性遗传规 律。 关键词：农杆菌介导；pta基因；sb401基因；总蛋白含量；赖氨酸含量 H ABSTRACT sativa one L．)is ofthemost food intheworld，anditis Rice(Oryza importantcrops also foodofmorethan in the China．But fifty damage staple percentpopulation