医药废水中大肠菌免疫快速检测方法研究.pdfVIP

A Dissertation Submitted to Shanghai Jiao Tong University for the Master Degree of Engineering Development of the Immunoassay Method for Rapid Determination of E.coli in Pharmaceutical Wastewater Author: Zhiguo Fan Specialty: Environmental Science Advisor: Prof. Huisheng Zhuang School of Environmental Science and Engineering Shanghai Jiao Tong University Shanghai, P.R.China Jan ，2011   万方数据 万方数据 万方数据 摘要  摘 要     世界各国的专家和学者都在努力寻找一种快速检测大肠杆菌的新方法， 目前已经发展了分子生物学检测方法、酶底物法及免疫学方法等。 本文从医药废水中筛选出大肠杆菌，制备免疫原，采用多克隆抗体制备 技术制备了抗大肠杆菌抗体，并建立了间接竞争酶联免疫吸附法，并在此 基础上研制了间接 ELISA 试剂盒，具体成果如下： 1.从医药废水中筛选大肠杆菌，制备大肠杆菌全菌体免疫原，然后，使 用该免疫原对新西兰大白兔免疫，获得兔抗大肠杆菌免疫血清，经过辛酸- 硫酸铵两步法纯化后获得抗血清，其效价为12800，经过计算纯化后抗体的 蛋白质的含量为2.50mg/mL。 2.建立了大肠杆菌的间接ELISA 快速检测方法，优化确定了具体实验参 数：包被抗原的最佳使用稀释度为 200 倍，酶标二抗和一抗的最佳稀释度 分别为2000 倍和12800 倍；0.5%BSA为最佳封闭液，封闭2h 作为最佳封闭 时间；选择 37℃温育 60min，含 4%PEG 稀释液作为最佳的抗原与一抗的反 应条件；选择 37℃温育 60min，含 4%PEG 稀释液作为最佳的一抗与二抗的 温育条件。 3.进行了大肠杆菌的梯度实验，浓度在1012cfu/mL－10cfu/mL 之间，用 所建立的间接竞争 ELISA 法测定，结果表明在 103 9 cfu/mL－10 cfu/mL 有良 好的线性关系，表明ELISA的检测限为103cfu/mL。将预处理后的医药废水 梯度稀释，用所建立的间接竞争ELISA 法测定，同时与国标法（MPN 法）和 活菌计数法做比较，结果表明间接 ELISA 测得结果与 MPN 所测结果一致， 但是由于间接ELISA 对死菌能检出，所以检测值较MPN 法大。 4.制备了间接ELISA 试剂盒，对所组建试剂盒进行了包被时间的优化， 试验结果表明该试剂盒在37℃下包被 1h，与在4℃下包被过夜所测的OD 值 相近，所以本试剂盒选择在 37℃下包被 1h