creloxp位重组系统在植物雄不育和杂种优势中的利用研究.pdfVIP

堕主兰堡笙奎 里型!!竺塞堡重望至竺垄堕塑堡至蔓塑茎壁垡茎±堕型旦里窒查苎查兰竺!!兰一 摘 要 Cre—loxP是来源于噬菌体Pl的一种位点特异性重组系统。目前，它已广泛应用于 基因功能鉴定，动植物及微生物基因组的修饰以及基因的表达和调控。雄性不育系在 杂种优势的利用中具有重要意义。它的应用能够简化制种程序，降低种子成本，提高 种子纯度，带来更大的经济效益。本实验麓r是以Cre．10xP系统调控细胞毒素基因barnase 荏植物雄性器官发育的特异时期在特异组织表达，从而达到控制植物育性的目的。 ／1．在本实验中，通过PCR方法克隆了解淀粉芽孢杆菌Bacillusamylo幻uefacien$的 b扣∞e基因，克服了其极强的致死效应，构建成功双元表达载体及基因枪转化载体， 井已获得经分子检测呈阳性的小麦植株。 2．参照PaddonCJ等的研究结果，设计了barnase的抑制因子barstar的引物序列， 通过PCR方法克隆得到了完全正确的barstar基因。含有该基因的用于小麦及烟草的 育性恢复的双元表达载体已经成功构建，并且得到了转基因阳性植株。 3．os96B是来源于水稻花药绒毡层的特异性的启动子，它在小孢子发育的四分体 时期至单核花粉期在花药绒毡层中特异启动基因的表达，它具有较为严紧的时空特异 性。以os96B为启动子，构建了一组受控于Cre／loxP位点特异性重组系统的适用于基 因枪法转化小麦的载体系统。目前，转基因小麦己分别得到且自交后代已经播种。另 外，以含有Cre基因的转基因小麦为母本，以含有阻断序列的小麦为父本所进行的组 合后代已种入田间，交配后代的育性情况正在进一步的观察、检测中。 4．对应于小麦的基因枪法转化载体系统，仍以os96B为启动子，构建了～组受控 于Cre／IoxP的用于控制双子叶植物育性的双元表达载体系统。目前，已获得转基因烟 草自交种子。以转阻断序列结构为母本，以转Cre基因为父本所进行的杂交组合种子 也已经获得。 5．转不育基因(096B—bamase)小麦植株生长正常，但开花后，花粉量明显减少， 自交不能得到正常种子。进行花粉活力检测发现，转基因小麦大部分花粉表现为败育。 花粉离体萌发试验表明，转不育基因小麦的花粉离体萌发率极低，几近败育。说明以 os96B驱动barnase在小麦花药中的表达可以导致雄性不育。 6．以转cre基因的烟草作为受体，以含阻断序列的质粒农杆菌进行二次转化。二次 转化株营养生长正常，但开花期花器官表现异常。具体表现为花瓣异常开裂或不开裂， 花丝变短或粘连，花药提早萎蔫或异常开裂。推测这种现象的出现与启动子的组织特 异性或bmnase的渗露表达有关。 7．二次转化株花粉染色因不同株系出现全部败育、部分不育和多数可育的情况。 花粉离体萌发实验也得到了相似的结果。这说明通过筛选，利用Cre／loxP得到完全不 育的植物株系是完全可行的。 I 王 勇 摘 要 2002年5月 8．获得了9个bamase的突变体，初步推测第十四位氨基酸及第八十位氨基酸与核 糖核酸酶活性有关。同时，发现bamase的第316位核苷酸序列为易突变位点，自然 发生的突变多插入一个C，从而产生终止位点的改变。这或许会为今后barnase的克隆 与利用提供一些参考。 ． 关键词：ere-IoxP位点特异性重组系统，转基因雄性不育，核糖核酸酶基因，杂 秽优势，绒毡蜃；二硅启动子 II 苎圭兰焦笙苎 !型生!塞堡墨望墨竺壅竺望堡至!塑塞翌垡塑主塑型里翌塞』墨苎窒坐：!!兰一 Abstract from hasbeen isa recombination Cre／IoxP phageP1．Presently,it site．specific system