二倍体d组棉种色体特异bac克隆的筛选及其应用.pdfVIP

摘要 棉花是世界上最重要的纤维经济作物。目前，棉花的全基因组测序工 作已进入同程，而棉花高分辨率细胞遗传学图的构建是基因组研究中重 要而基础的工作。以遗传图谱不同染色体上的分子标记为媒介，在BAC文库中 筛选并获得染色体特异的BAC克隆，以它们为探针进行荧光原位杂交完全识别染色 体进而对遗传图与细胞学图进行整合的策略在其它作物中得到了广泛应用。 为加快棉花高分辨率的细胞遗传学图的成功构建，本研究对染色体特异 BAC克隆的筛选、鉴定等工作进行了一定的尝试，并且经过实验论证得到了一套可 以识N-倍体D组染色体的特异BAC探针。在获得两种rDNABAC克隆的基础上， rDNA、5S 对7个二倍体组棉种的rDNA位点分布进行了探讨。应用45S rDNA及D 组着丝粒区域BAC探针，在瑟伯氏棉粗线期染色体上构建了高分辨的棉花细胞学 图，这为D组染色体的特异BAC探针在粗线期上的最终应用及构建D组棉花高分 辨率的细胞遗传学图，奠定了工作基础。 研究结果如下： · et 利用来自于遗传连锁图谱(Han BAC文库中分别 筛选到的425．D．2、429．J．7、189．I．4 以做为识别棉花Chr．3、Chr．10、Chr．25的染色体特异BAC探针。 · 在得到一套棉花染色体特异BAC克隆的基础上，利用双色FISH技术，以本 实验室筛到的D组着丝粒区域探针(BAC150D24)区分染色体长短臂，成功地 将13个Dt组染色体特异BAC克隆分别定位在二倍体D组瑟伯氏棉中期染色体 能产生染色体特异的荧光信号。并通过Dt组与D组染色体的同源转化关系确定 了D组染色体的命名。 ●物理图谱与遗传图谱的比较作图分析13个Dt组染色体特异克隆中，尽管部分 标记位于连锁群的中部，但相应克隆的原位杂交定位显示，其位于染色体的末 端或近末端处，这暗示了棉花基因组中染色体的远端往往是重组活跃区段；也 有位于遗传连锁图木端或近末端处的分子标记被定位在染色体中部的情况，这 可能足连锁群的覆盖度较低造成的。13个探针在Dt与D组染色体上物理分布 有较好的一致性，证明了Dt与D组染色体间确实存在大片段的染色体同源区段。 ◆鉴于rDNA自身为高度重复序列，可做为识别染色体的FISH标记。本实验利用45 S和5SrDNAaJl物，从Pima90BAC库中筛选得到4个45SrDNABAC克隆： rDNA 181．C．3、181．J．1l、183一C-22、183一G．12；2个5SBAC克隆：182一F一9、 rDNA 188。H．17，并通过FISH对其进行了验证。对得到的45SBAC克隆进行BAC 末端测序，从中得到了一段533bp的DNA片段，在NCBI数据库中与已知序列进 行BLAST}[,对，结果与茶树、木棉树、玉兰、莲属以及一些动物的28S序列同源 达到98％。 · 在获得棉花rDNA 组二倍体棉种的各自代表种为研究对象，探讨其rDNA位点及7个组的45S与 5S线性关系情况。发现所用7个组的二倍体棉种45S信号多为3．4对，但信号 强度大小不尽相同；5S信号除E组的灰白棉为2对外其它均为l对。45S与5S 线性关系：A、C、D、F、G组的45S与5S均为共线性形式存在，而B组的两 个棉种及E组的索马里棉、亚雷西棉，其45S与5S是非共线性的；E组的灰白 棉5S位点为2对，其中一对单独存在，而另一对与45S位点共线性。发现的特 殊rDNA位点染色体组—B、E、F组，在棉属分类工作中可以起到重要的作用。 总结四种rDNA位点分布模式，就rDNA的演化过程推测：二倍体棉种中，非 共线分布——_B组棉种及与其相近的E组棉索马里棉、亚雷西棉为最接近棉属 祖先的原始种群，它朝着45S和5S染色体间的共线性的方向演化，期间E组的 灰白棉、F组的长萼棉处于整个二倍体棉种中比较“动