茶树花粉特异蛋基因cspsp1的荧光定量分析及rnai抑制.pdf

II 摘 要 荧光定量PCR技术与RNAi技术都是上世纪九十年代分子生物学领域新兴的研究 技术。荧光定量PCR技术是对生物基因表达从定性到定量的一个跨越；RNAi技术是 研究基因功能，并能快捷高效抑制基因表达的方法。它们将会在未来的生物技术研究 领域发挥越来越重要的作用。 茶树是我国重要的经济作物，其主要利用价值都集中在叶片上，从而对品质的改 良和产量的增加等研究较多，但对于茶花的研究就相对很少，当然，在茶花基因水平 上抑制茶树生殖生长来反向提高茶树经济产出的研究就更是微乎其微，本实验就是研 究茶花发育过程中的相关基因，为这一较为空白的领域做一些铺垫性的研究。 1、本实验以黄山早芽、乌牛早、舒茶早、龙井43 四个茶树品种的花蕾为材料， 并将每个品种的花蕾按发育的早、中、晚三个期进行分类。以早期花蕾为对照组比较 花蕾发育的各个时期基因表达量的差异，利用荧光定量PCR 的方法确定不同时期花蕾 的CsPSP1基因表达量。实验结果表明, 黄山早芽、乌牛早、舒茶早、龙井 43 四个品 种的CsPSP 1基因表达量，中期花蕾分别为早期花蕾的1.8、2.7 、2.5 、6.5倍；晚期花 蕾分别为早期花蕾的2.5 、3.7、3.1、44.2倍。以上结果表明在发育过程中，CsPSP1基 因的表达量.呈上升趋势，其中龙井43花蕾的早、中、晚三个阶段的基因表达量增加 显著，这可能由品种的差异造成的。通过对实验数据的分析，推断CsPSP1基因为茶 花发育的晚期基因。 2 、在荧光定量试验的基础上，挑选茶树龙井43 品种的后期花蕾为实验材料，进 行普通反转录得到cDNA第一链。同时，根据GenBank上登录的茶树花粉特异蛋白基 因CsPSP 1 （DQ887753 ）的序列，设计一对特异引物进行PCR反应。将扩增后的基因 片段先链接到克隆载体pGEM-7zf(+) 中，然后再反向插入pBI121表达载体，并测序。 结果表明，插入pBI121载体的片段长度为318bp，与已知序列进行比对后一致性达到 99.02%，说明载体构建成功。 3 、以构建好的反义载体pBI121-asCsPSP1为模板 ，设计引物 ，扩增出片段 asCsPSP1-GUS ，其中的GUS只是载体整个GUS基因的一段。之后先插入到重组子 pGEM-asCsPSP1中，构建重组质粒pGEM-dsCsPSP 1，之后用内切酶切下片段dsCsPSP1 插入到pBI121 中，构建双链表达载体pBI121- dsCsPSP1。由实验结果可知插入的双链 长度约为1000bp，中间有一段长400bp左右的GUS片段将CsPSP1的正义链和反义链隔 开，重组质粒由酶切验证，表明双链载体构建成功。 4 、将构建好的反义表达载体和双链表达载体分两次导入到茶树中，所用的方法 为花粉管通道法，实验每次都处理了500朵花，导入品种仍然为龙井43 。次年收集自 然成熟的种子进行种植，根据结果所示，茶树的生长状况良好，为之后进行生物学鉴 I 定做好准备工作。 关键词：茶树，荧光定量PCR ，反义表达载体，RNAi表达双链，茶树花粉光通道法 II Abstract Real-time fluorescent quantitative PCR (qPCR)and RNA interfering (RNAi) ， generated in 1990s，are burgeoning technologies in the field of molecular biology. qPCR is a leap for biological gene expression from qualitative to quantitative. RNAi technology is