茶黄素的酶促合、分离鉴定及功能研究.pdfVIP

茶黄素的酶促合成、分离鉴定及功能研究 摘 要 茶黄素是指红茶中溶于乙酸乙酯呈橙黄色的物质，由茶多酚(主要是儿茶素 类及其衍生物)在多酚氧化酶存在下氧化缩合而来。红茶中茶黄素的含量约为 0．5％～3％，但茶黄素不仅是红茶的重要品质成分，而且具有多种药理功能与保 健功效，如降血脂、抗氧化、抗衰老、抗突变、抗癌防癌等，在某些功能方面甚 至优于儿茶素。红茶茶黄素类物质的研究与开发是继茶多酚、儿茶素之后近年来 兴起的又一热点，不仅具有重要的理论价值，而且在天然药物、保健品、化妆品 和日化用品等领域具有广阔的产业化前景。但是，茶黄素的化学研究不能满足医 药领域研究的要求，如茶黄素的提纯难度较大、性质欠稳定等限制了药用研究的 深入。所以，到目前为止，茶黄素提制的产业化工艺技术尚不成熟，表现为产品 纯度低、成本高、产能低，严重阻碍了以茶黄素为原料的天然药物及功能性食品 的研究开发。同时，由于结构的相似性，茶黄素类物质单体的分离非常困难，直 接从红茶中分离茶黄素单体更加困难。由于红茶中茶黄素的含量低，依靠红茶为 原料来提制茶黄素成本过高，必须研究如何采用儿茶素为原料，筛选特异多酚氧 化酶酶源，利用酶促氧化合成茶黄素，研究茶黄素合成机理，具有重要的理论与 实际意义。因此，本研究设计了一种利用植物或微生物多酚氧化酶氧化儿茶素混 合物体外合成茶黄素复合物的方法。并通过调控底物儿茶素的组成比例来调控氧 化产物中茶黄素各组分的组成比例。采用聚酰胺柱色谱结合制备液相色谱、高速 逆流色谱，对茶黄素复合物进行分离，拟得到4种茶黄素单体，其化学结构由‘H NMR，uC NMR，UV，取和MS表征。并采用高通量筛选模型对茶黄素单体的 降血脂、抗炎和抗肿瘤活性方面进行了系统深入的研究。 1多酚氧化酶的优选及合成茶黄素的研究 采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳技术，研究了不同来源(茶叶、苹果、梨、 蘑菇和漆酶)的多酚氧化酶同工酶的酶带特征。结果表明，不同来源多酚氧化酶 同工酶具有相似的酶带，但对酶带数目、Rf值及分子量均存在种问差异。梨有 ll条同工酶带，苹果4条，茶叶有5条，蘑菇5条，而漆酶只有l条。PPO同 工酶带Rf值集中于0．40～0．70的区间内。茶叶多酚氧化酶同工酶的相对分子量 大于94000，而梨、苹果、蘑菇和漆酶多酚氧化酶同工酶的相对分子量介于45 000～94 000。同时研究了多酚氧化酶活性和同工酶组成对茶黄素合成的影响。 合成茶黄素能力大小顺序为：梨PPO，茶叶PPO，微生物PPO，苹果PPO，漆 酶PPO，蘑菇PPO。其中，在所有梨品种中，丰水梨果实多酚氧化酶同工酶谱 带最多，酶活性最大，合成茶黄素的能力最强。 2茶黄素的酶催化合成 利用丰水梨果实多酚氧化酶，在单因素试验基础上，设计正交试验，进行酶 性合成茶黄素，研究儿茶素组成、浓度和理化条件对茶黄素合成的影响，以确定 最佳合成条件。结果表明，可以通过氧化不同儿茶素组成比例的底物来调控氧化 产物中茶黄素各组分的组成比例。以儿茶素混合物C(EGC200mg／g，EGCG200 mg／g)为材料，茶黄素酶促合成的最佳条件为：反应体系 mg／g，儿茶素总量500 mg／nd，酶添加量为49162．50U， 的最佳pH值为5．5，温度为30C，底物浓度为5 最佳反应时间40 rain。pH值和几茶素浓度是反应体系中两个重要的影响因子 (PO．05)。应用多元线性回归模型，研究了儿茶素混合物C酶性氧化参数对制 备茶黄素复合物的综合效应，以茶黄素为目标，建立了儿茶素混合物c酶促氧 黄素总量，Xl：pH，X2：温度，X3：儿茶素底物浓度)。根据回归模型，并结合各单因素 试验，综合优化方案与上述正交实验结果相吻合。 3茶黄素单体的分离及结构鉴定 用高速逆流色谱分离纯化茶黄素，以正己烷．乙酸乙酯．甲醇．水．冰醋酸 (1：5：l：5：O．25，v／、，，v／v／v)为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，流速为2 mL／min，仪器转速700r／rain，进样量30 mg。尤其使得两种茶黄素同分异构体(茶 黄素．3．没食子酸酯、茶黄素．3’．没食子酸酯)达到较好的分离。从茶黄素粗提物中 分离纯化得到茶黄素、茶黄素．3．没食子酸酯、茶黄素．3’．没食子酸酯和茶黄素