草莓转基因再生系的建立及早花基因pcft的转化.pdfVIP

摘 要 草莓(FragariaXanGn口ssGDuch)是世界上最重要的草本果树之一，生长周期短， 果实风味浓郁、香味独特，是最好的城市圈经济栽培的浆果。草莓花芽分化需低 温和短日照，在露地栽培条件下4月底5月初成熟，供应期较短；促成和半促成 栽培条件下，虽然果实成熟期可扩大至11月底～次年5月，但其余季节里仍无果 实供应。如何调控其花芽分化，在适宜的时间结果，扩大其市场供应期，提高经 济效益，是科研和生产中需要解决的一个重要课题。植物基因工程的发展和应用 为草莓育种开辟了一条新途径。由于农杆菌介导的遗传转化主要依赖于受体材料 的再生能力及农杆菌的转化效率，因此，良好而高效的受体再生体系的建立是进 行成功的基因转化关键所在。本试验以草莓品种‘红颊’和‘丰香’为试材，以 草莓叶片和花药为外植体，研究了离体再生过程中基因型、外植体、激素配比、 暗培养时间等对不定芽再生效率的影响，建立了草莓叶片高效离体再生体系。在 此基础上，对影响农杆菌转化效率的主要因素进行筛选，建立了农杆菌介导的转 化体系，将早实枳中分离获得的早花基因PcFT导入草莓，获得转化植株。Km 筛选、PCR检测证明目的基因已经整合到草莓基因组中。 主要研究结果如下： 1．研究了草莓‘红颊’花药再生的影响因素 TDZ 以花粉发育时期为单核靠边期的草莓红颊花药，在培养基MS+I．0mg／L +O．4 IBA上诱导效果最佳，绿苗分化率达到12．3％，单倍体诱导率为 mg／L 1．1l％。 2．建立了草莓叶片离体再生体系 在不定芽诱导中以MS+I．5TDZ+0．4IBA对草莓‘红颊’叶片诱 mg／L mg／L 导效果最佳，适量暗培养有助于提高再生频率，暗培养4周再生频率可达为 TDZ+0．6 67．8％；以MS+1．0 IBA，暗培养3周对丰香诱导效果最好， mg／L mg／L 再生频率可达78．7％。草莓‘红颊’再生难度及价值比‘丰香’高，选择草莓红 颊进行进一步遗传转化的研究。 3．构建了表达载体pBll21．力。 4．建立了草莓遗传转化体系，并获得一棵草莓品种‘红颊’转化植株。 在根癌农杆菌介导的基因转化中，确定了有效的Km选择压为10 mg／L。通 CeL 过抑菌实验，确定了合适的抗菌素及其浓度，即400mg／L 对影响农杆菌转化效率的各种因素进行筛选，得到了一条最佳的转化途径： 叶片在分化培养基上预培养时间为3天；农杆菌培养至对数生长期，用MS+TDZ 1．5rag／L+IBA0．4mg／L液体培养基重新稀释悬浮培养；调整菌液浓度为 OD600=0．3．O．5；侵染叶盘组织约10分钟；共培养3天；然后，延迟2周筛选， 即将外植体接到含有400 Cef的诱导培养基上进行培养，2周后再转接到含 mg／L 有选择压10 mg／LKm和400mg／LCef的诱导培养基上进行选择培养。 5．转基因植株PCR检测 经10 mg／LKm选择压初步筛选出10棵‘红颊’转化植株，以未转化植株为 阴性对照，质粒DNA为阳性对照，PcFT基因的两端序列作为特异引物进行PCR 扩增检测。检测结果表明：在这些植株中有1棵植株经PCR扩增出的特异条带 和阳性对照一致，阴性对照未能扩增出任何条带。这表明＆乃基因已整合进这 些植株的基因组DNA中。 关键词：草莓；早花基因；脚基因；再生；根癌农杆菌遗传转化 ll Abstract isoneofthemost herbaceouscommercialfruit inthe Strawberry important