脂肪氧合酶的分离纯化及其催化多不饱和脂肪酸的研究.pdfVIP

摘要 摘要 脂肪氧合酶(Lipoxygenase，EC1.13.11.12 ，简称LOX)属氧化还原酶。由于大豆中的 脂肪氧合酶活性比其它植物中的活性都要高，因此从大豆中提取 LOX 的效率较高，从 而大多数研究都是以大豆中的 LOX 为模型来进行的。植物产生清香风味成分的基本途 径是多不饱和脂肪酸在脂肪氧合酶（LOX ）的作用下与O2 结合，形成脂肪酸氢过氧化 物；后者又作为氢过氧化物裂解酶（HPL ）的底物被裂解；随着 LOX 和 HPL 酶特异 性的不同，将分别产生 C6、C9 或 C10 醛。 本文研究 LOX 的提取及纯化方法，得到纯度较高的LOX ，对其理化和酶学性质进 行了研究，并对第一步 LOX 反应，在酶反应器和反应条件优化方面，针对反应体系中 水-油-气三相共存，传质机理复杂的情况，研究合适的反应条件，提高传质速率，寻求 最佳工艺路线，使脂质过氧化物转化率尽可能最大并为 HPL 制备 C6 醛风味物质提供良 好的基础。 LOX 分离纯化的研究中，脱脂豆粕经硫酸铵分级沉淀，透析，经 DEAE-Sepharose FF 柱层析后，比活力从 3.54 U/mg 提高到 105.7U/mg，纯化倍数为29.9 ，回收率是 30.9 ％。 特性研究表明大豆 LOX 的最适pH 值为 9.0，在较低温度下酶活能保持较高水平，用双 倒数法求得大豆中脂肪氧合酶 Km=80.6μmol/L ，Vmax=54.2μmol/(L•min) 。 用 HPLC 和 LC-MS 法，确定了 LOX 催化反应体系的影响因素与氢过氧化脂肪酸产 率和催化选择性等方面的关系，得到最优反应条件，以亚麻酸为底物的催化反应， 0.025mol/L 的亚麻酸和2.5U/ml 的酶在pH9.0 ，4 ℃，2atm，转速为 800r/min 的条件下反 应 1.5h，在该条件下反应转化率为 83%，亚麻酸氢过氧化物纯度为 87%。以亚油酸为底 0.01mol/L 的亚油酸和0.33U/ml 的酶在pH9.0 ，4 ℃，3atm，转速为 800r/min 物的催化反应， 的条件下反应 1.5h，在该条件下反应转化率为 81.3%，亚油酸氢过氧化物纯度为 97% 。 高底物浓度反应下，0.3mol/L 的亚麻酸，0.15% Triton X-100，0.044gBHT 和 20U/ml 的LOX 在 pH9.0 ，4 ℃，2atm 的条件下反应 1.5h，该条件下反应转化率为 81.87%。0.3mol/L 的亚油酸，0.2% 的Triton X-100，0.08gBHT 和 15U/ml 的LOX 在 pH9.0 ，4 ℃，2atm 的 条件下反应 1.5h，该条件下反应转化率为 71.7% 。 在低底物浓度下，底物为亚油酸时，用纯酶反应的转化率比粗酶稍高，而底物为亚 麻酸时，用粗酶或纯酶进行反应，转化率基本没什么变化，然而高底物浓度情况下，不 论是以亚油酸还是亚麻酸为底物，用纯酶反应的转化率都比用粗酶的要高，说明在高浓 度情况下，用纯酶反应效果较好，可以提高反应转化率。 低温下，用乙醇保存的氢过氧化物比未用乙醇保存的氢过氧化物要稳定的多。 LOX 反应产物的分离鉴定表明，产物除了有脂肪酸氢过氧化物外，还有少量的氧 代二烯酸以及羟基酮，除此之外，其他物质还需进一步研究鉴定。 关键词：大豆脂肪氧合酶，分离纯化，催化反应，氢过氧化物，转化率，LC-MS ， HPLC I Abstract ABSTRACT Lipoxygenase (Lipoxygenase, EC1.13.11.12, LOX) is an oxidoreductase, as the activity of soybean lipoxygenase is higher than that of other plants, and LOX whic