伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬通量的影响和作用时相的研究.pdf

伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬通量的影响和作用时相的研究 中文提要 伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬通量的影响 和作用时相的研究 中文提要 目的： 研究伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar typhi, S.typhi ）质粒pRST98 对巨噬细 胞自噬动态过程的影响，探讨该质粒与沙门菌感染时巨噬细胞自噬体及自噬溶酶体的 关系，揭示pRST98 对自噬通量（autophagic flux ）的作用时相，为通过调控细胞自噬 水平来防治细菌感染的新策略及新药研发提供理论和实验依据。 方法： 一、伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬的影响 以携带 pRST98 的伤寒沙门菌野生株 ST8 ，消除 pRST98 的伤寒沙门菌突变株 ST8-ΔpRST98 和将 pRST98 经接合转移重新导入 ST8-ΔpRST98 所获得的回补株 ST8-c-pRST98 ，按感染复数（multiplicity of infection ，MOI ）100:1 感染小鼠腹腔巨噬 细胞J774A.1 ，建立细胞感染模型，同时设自噬诱导剂雷帕霉素（rapamycin ，RAPA ） 干预组。分别于细胞感染后 1~3 h 收集细胞，透射电镜（transmission electron microscope ，TEM ）观察细胞超微结构；流式细胞术（flow cytometry，FCM ）和免疫 印迹法 （western blot ，WB ）检测自噬蛋白LC3-II 、Beclin- 1 的表达；用红色和绿色 荧光蛋白偶联的LC3 真核细胞表达载体mRFP-GFP-LC3 瞬时转染巨噬细胞，共聚焦 激光显微镜 （confocal laser scanning microscope，CLSM ）观察LC3-II 点状聚集，并 用免疫组化法做平行对照；平板菌落计数法检测胞内活菌数（colony-forming unit ， CFU ）。 二、伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬通量及作用时相的影响 由于伤寒沙门菌的严格宿主特异性，使其缺乏理想的动物模型，为今后进一步在 动物活体内研究pRST98 与细胞自噬的关系，本部分实验用与伤寒沙门菌有非常近缘关 系的鼠伤寒沙门菌作为研究对象，研究该质粒对巨噬细胞自噬通量的影响。以携带一 分子量为100 kb 毒力质粒的鼠伤寒沙门菌 （Salmonella enterica serovar typhimurium， I 中文提要 伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬通量的影响和作用时相的研究 S.typhimurium ）标准毒株χ3306 、将其质粒消除后获得的鼠伤寒沙门菌突变株 χ3337 和将质粒pRST98 经接合转移导入χ3337 后形成的鼠伤寒沙门菌接合子χ3337/pRST98 为 受试菌，同第一部分建立感染模型。分别设饥饿诱导组 （无血清RPMI 1640 培养液 处理细胞）、溶酶体抑制剂氯喹 （chloroquine，CQ ）干预组和常规细胞感染模型组。 于感染后1 h 收集细胞，用Giemsa 染色法观察各感染组细胞状态及感染情况；CLSM 观察转染mRFP-GFP-LC3 的巨噬细胞内自噬蛋白LC3-II 的点状聚集；WB 检测自噬 标记蛋白 LC3-II 及自噬底物蛋白 p62 的表达；将荧光素酶报告基因lux 导入以上 3 株受试菌染色体，获得发光菌χ3306lux、χ3337lux 及χ3337/pRST98lux，用小动物成像 仪检测相应细菌的生物发光量，直接分析感染细胞内CFU 。 结果： 一、伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬的影响 （1）TEM 结果显示，感染后1~3 h，ST8-ΔpRST98 感染组细胞中可观察到典型的 自噬体和自噬溶酶体；ST8 和ST8-