植物发育生物学实验指导.doc

植物发育生物学实验指导 张 蕾 赵 洁 武汉大学生命科学学院目 录 实验室安全守则 第一部分 植物组织培养 实验一 植物培养基的配制 实验二 植物材料表面消毒灭菌——烟草无菌苗的培养 实验三 水稻种子愈伤组织的培养和小苗的再生 第二部分 植物转基因技术 实验一 农杆菌的培养、感受态的制备和质粒转化农杆菌 实验二 拟南芥转基因操作 实验三 烟草转基因操作 实验四 水稻转基因操作 实验五 基因枪法转化洋葱表皮细胞 实验六 聚乙二醇介导的烟草叶肉原生质体的转化 第三部分 基因功能研究及转基因植物分析和鉴定的方法 实验一 利用抗性标记基因筛选转基因植株种子 实验二 转基因植株中GUS活性检测 实验三 Southern杂交 实验四 Northern杂交 实验五 转基因植株蛋白质水平的检测（Western blot） 实验六 转基因植株的表型及细胞水平上的鉴定 实验七 植物组织石蜡切片的制作 实验八 烟草小孢子和大孢子的发育过程的观察 实验九 花粉表型的观察 实验十 透明法观察拟南芥胚胎发育过程 实验十一 mRNA原位杂交技术 实验十二 T-DNA插入位点基因的克隆和鉴定（Tail-PCR技术） 实验十三 T-DNA插入突变体的鉴定 实验十四 利用RT-PCR方法研究基因在植物中的表达 实验十五 Real-time PCR方法定量研究基因在植物中的表达 实验十六 酵母双杂交实验研究蛋白质之间的相互作用 实验十七 免疫共沉淀方法研究蛋白质之间的相互作用 实验室安全守则 一般规定 1．在实验室內请穿着实验服，避免穿拖鞋。 2．在实验室内禁止吸烟、饮食、嬉戏奔跑，实验桌上勿堆放书包、衣服及杂物等。 3．所有实验仪器、耗材、药品以及实验材料等均属实验室所有，不得带出实验室。公用仪器请爱惜使用。保持环境卫生。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。 4．实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作规程。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实验程序。实验后确切记下自己的结果，严禁抄袭。 5．实验完毕，确定关闭不用的电源、水、酒精灯等。 药品 1．挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、?-巯基乙醇、酚等）要在通风橱中戴手套量取配制，取用完后随即盖好盖子。 2．有毒、致癌药剂例如丙烯酰胺（神经毒）、溴化乙锭（突变剂）、SDS、秋水仙素请戴手套及口罩取用。 3．接触到病原材料或细菌，应迅速消毒。所有被污染的物品，在丢弃或重复使用前均需先灭菌，固体培养基不得倒入水槽或下水道中。 仪器 1．使用仪器前先了解其性能、配置及正确操作方法，零件及附件严禁拆卸，勿私自调整。 2．使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡，锁紧离心机转陀。冷冻离心机于开机状态时，务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。 3．实验时不要用潮湿有汗的手去操作电器，不要用手紧握可能荷电的电器，不应以两手同时触及电器，电器设备外壳均应接地。万一不慎发生触电事故，应立即切断电源开关，对触电者采取急救措施。 4．超净工作台內的有机溶剂及易燃物（如甲醇、乙醇、乙醚、瓦斯等）要远离火苗。酒精或乙醚等着火时，应使用泡沫灭火剂或湿毛巾覆盖，勿使用水冲洗。 第一部分 植物组织培养 植物组织培养是指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。外植体主要有原生质体（Protoplast），悬浮细胞，组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织），器官（胚，花药，子房，根和茎）的培养。其中最常见的是愈伤组织培养。愈伤组织（Callus）原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。 植物的组织在一定的培养条件下，原来已经分化并停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程被称为“脱分化作用” （dedifferentiation）。已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成芽和根等组织或器官，这一过程被称为“再分化作用” （redifferentiation）。植物激素在“脱分化作用”和“再分化作用”过程中起着重要的作用。 植物组织培养的意义： 1．基础理论研究：试验体系的准确性和可重复性，广泛用于细胞、组织的代谢生理及其它生化等方面的研究，如分化问题。 2．应用研究：无性繁殖系快速繁殖的生产、试管苗的商品化、遗传育种、种质保存、克服远缘杂交、种质资源创新以及获得转基因植株。 实验一 植物培养基的配制 【实验目的】 1．了解植物组织培养基的组分及各组分的作